基于Orbitrap ID-X技术的中药柴胡体外肠内菌代谢物分析
前言：传统中药以口服用药为主，其化学成分受胃肠道酸碱性、肠道微生 物及代谢酶等影响常发生转化，使其生物利用度降低，体内除中药 原形成分外，还可能有大量代谢产物的存在，这些体内吸收化学 成分是阐明中药发挥药效机制的直接物质基础。要想揭示中药体内 药效物质，代谢产物研究是不可缺少的重要组成部分，尤其是苷类 及其他结构易转化的化学成分（如萜类等），其生物利用度较低， 在体内主要以代谢产物的形式存在，在此种情况下，代谢产物可能 是药效的主要来源[1]。然而，由于中药成分的代谢规律不明 确、代谢产物含量低难以鉴定等原因，大大制约了中药体内药效物 质基础的研究。
为了更加深入的研究中药体内药效物质基础，需要利用高分辨质谱 对中药体内代谢物进行更深度的鉴定分析。然而由于中药体内的代 谢物通常含量很低，且同时受到基质背景的干扰，传统LC Q-TOF MS高分辨质谱的DDA数据采集模式难以获得低含量代谢物的二级 质谱图用于结构鉴定。新一代赛默飞Orbitrap ID-X Tribrid三合一质谱仪由 于具有Acquire X智能化数据采集模式，自动迭代生成排除列表及 包含列表，可以获得极低含量组分的多级质谱用于代谢物的深度分 析。
柴胡Bupleuri Radix为伞形科植物柴胡（又称北柴胡）Bulpeurum chinese DC. 和狭叶柴胡（又称南柴胡）Bulpeurum scorzonerifolium Willd的干燥根，其性味苦凉、微寒，具有解表和里、疏肝解 郁、升举阳气之功效[2]。柴胡化学成分复杂，其中皂苷类、挥发油 类、黄酮类为柴胡的主要活性成分，具有免疫调节、抗抑郁、保 肝、抗肿瘤、解热抗炎等药理作用[3-5]。近年来，液相色谱-质谱联 用技术（LC-MS）的成熟与发展已被应用于柴胡皂苷类组分的代谢研究[6,7]。然而，单个活性组分的代谢研究以及部分代谢物的鉴定结 果仍然无法全面综合的评价柴胡的质量和体内药效物质基础。
本实验采用离体实验的代谢研究方法，通过具有AcquireX采集功能 的Orbitrap ID-X Tribrid MS技术对柴胡代谢产物进行整体分析。首先 用富含肠内菌的粪便悬浮液与柴胡提取物在厌氧条件下温孵，利用 Compound Discoverer 3.0代谢物分析软件对采集的高分辨质谱数 据进行解析，最终构建柴胡的肠内菌代谢指纹图，以期为中药的临 床合理应用奠定理论基础。
实验方法
1. 样品前处理 取柴胡粉末约20g，加入150mL 70%乙醇置于圆底烧瓶中，加热 回流提取60min，离心后取上清液，抽滤后滤液旋转蒸发浓缩至20 mL，冻干保存。肠内菌液的收集与制备参考文献[8]，培养时间分 别为0小时（对照组），1小时和24小时作为实验组样品。用等量 的磷酸钾缓冲溶液代替底物溶液，其它操作同实验组，此作为空白 组。
2. 色谱方法 超高效液相UHPLC（Dionex Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific）系统进行色谱分离，该系统由真空脱气机，自动进样器，柱 温箱，和二元泵组成。色谱柱为Hypersil Gold C18（2.1 mm × 100 mm，1.9μm，Thermo Fisher Scientic）；流动相为0.1％甲酸水 （A）和乙腈100%（B）。流速为0.3mL / min，进样体积3uL， 柱温40℃；采用梯度洗脱：起始，5%（B）；0-1min (5%-5％B)； 1-5min (5%-50％B)； 5-19min (50%-98％B)； 19-23min (98%-98％B)；23.1-25min (5% B)。
3. 质谱条件 仪器：Thermo Scientic Orbitrap ID-X Tribrid 三合一质谱仪，利用 AcquireX 智能数据采集模式获得HR MS/MS，±ESI 检测模式，离子 源参数如下：Spray Voltage ±3.5KV； Sheath Gas Pressure: 40arb； Aux Gas Pressure: 10arb； Capillary Temperature: 275℃； Heater Temperature: 350℃。质谱扫描参数：扫描范围 (Scan range)（m/z） ：120-1500；Full Mass分辨率(Orbitrap resolution)：120000，MS/ MS分辨率：30000；使用Xcalibur 4.1和 Compound Discoverer 3.0 化学工作站进行数据处理
实验结果和讨论
1. Acquire X智能化数据采集模式 中药代谢物由于其成分的高度复杂性，而且代谢物检测容易受到基 质的干扰，传统的DDA模式很难采集到低含量代谢物的二级质谱图 进行定性分析，Orbitrap ID-X中的Acquire X智能化数据采集模式可 以自动生成排除列表及包含列表，特别适合于复杂样品的深度分 析。AcquireX采集数据过程中，以溶剂作为空白对照，用于自动生 成排除列表，排除背景离子；柴胡体外肠内菌孵育样品用于生成包 含列表。采集过程中将自动进行数据处理，实时更新采集方法。如 某一离子已经触发了MS/MS碎片，在下一针采集将自动加入到排 除列表中，避免数据的冗余，节省出更多时间用于MS/MS离子的 触发（如图1所示）。
