利用基于磁珠的人类血清蛋白质表达谱从非病样中区分...
利用基于磁珠的人类血清蛋白质表达谱从非病样中区分急性淋巴性白血病
布鲁克·道尔顿公司（Bruker Daltonics）新研究出的CLINPROT?解决方案适于复杂蛋白质组表达谱模式的样品制备和模式获得以及比较分析。在一项先导性的研究中，利用CLINPROT系统，对37名急性淋巴性白血病（ALL）患者和40名对照人群的EDTA血清样本并进行分析，使用3种不同功能的磁珠（即：MB-HIC C8,MB-WCX，MB-IMAC Cu）制备样品，质谱结果表明具有高度的重复性。根据差异表达质谱峰，从每个组中抽取了30个样本建立起一个分类预测模型。该模型可成功地从7名急性淋巴性白血病患者和10名对照人群中区分出一个仅仅依靠CLINPROT判断的确诊病人。
前言
蛋白组表达模式诊断是一种很有前景的疾病早期检测工具[1]，并在将来可有助于减少侵入性治疗过程，如：活体组织检查等。
MALDI-TOF MS是一种检测大量多肽和蛋白质的独特方法，特别在识别反应生物机理和细胞途径状况的复杂蛋白质组图谱方面成效显著。液体（如血清、血浆、尿液或脑脊液）中多肽和蛋白质的MS分析要求对样本进行适当的预处理。
布鲁克·道尔顿公司提供了一套完整的CLINPROT工具，在蛋白质组学中，可用于多肽和蛋白质生物标志物样品的制备、检测和可视化研究。本系统包括基于磁珠的样本制备、MALDI-TOF质谱采集和用于数据库检测和比较的生物信息学工具包以及复杂生物标志物模式模型的发现（参见图1）。
图1：利用CLINPROT系统进行临床蛋白质组表达谱研究的工作流程
白细胞恶性增生造成的白血病在儿科肿瘤疾病中占到35%，是最常见的儿科疾病。85%的儿科白血病都是急性淋巴细胞白血病，每年在每10万人群（15岁以下儿童）中就有3.3人发病。
本文报道了首次采用CLINPROT系统从非病例样本中区分急性淋巴细胞白血病患者。
方法与仪器
研究人群
从37名急性淋巴细胞白血病患者和40名对照人群中获取蛋白组谱图。所有的77例血浆均取自白种人。对照组中有20名女性和20名男性，并再分为一个预备组（30例对照人群包括15名女性和15名男性）用作建模。另一组为10名对照人群，有5名女性和5名男性，用以确诊研究。健康对照人群的年龄为18-22岁。急性淋巴细胞白血病组同样再分为一个建模组（15名女性/15名男性），第二组用于确诊研究。急性淋巴细胞白血病患者的年龄为1-16岁。所有患者均要在输血或化疗前抽取血样。
样品制备及数据获得
临床医生提取的EDTA血浆样品解冻，以10μl分装后再次冷冻。利用布鲁克·道尔顿公司的MB-Kits （MG-HIC C8，MG-WCX，MB-IMAC Cu）分离、浓缩和纯化EDTA样品本。要求：EDTA血样解冻后，立即取5μl加入相应的磁珠中。根据产品描述，所有的纯化步骤要一步完成。
图2：采用疏水磁珠（MB-HIC C8）、弱阳离子交换磁珠（MB-WCX）和金属离子亲和-Cu2+ (MB-IMAC Cu)磁珠捕获EDTA血浆蛋白质和多肽的MALDI-TOF质谱图。
图3：获得质谱的重复性。将1例急性淋巴性白血病EDTA-血浆分成8个份，分别用疏水磁珠（MG-HIC C8）分离，利用CLINPROT机械臂操作，并采用MALDI-TOF MS进行分析。
使用α-氰-4-羟基苯丙烯酸（HCCA）作为基质为MALDI-TOF制备样品。将0.3g的HCCA溶解于丙酮/酒精（1：2）溶液中。之后，以10μl的基质溶液稀释1μl洗脱液。每个样品在一个MALDI-TOF AnchorChip?靶上点五次。Bruker autoflex? MALDI-TOF MS以线性模式运转，每个样本要经过总共300条激光的打靶（5次点靶，每次打靶2x30次）之后生成质图谱。
数据分析
利用ClinProTools?软件进行数据分析。ClinProTools利用大量高度复杂和精密的算法则用于建模，以区分病人和健康人。使用ClinProTools软件的基因算法，分析两组建模样本（30名淋巴癌病例和30名对照人群）的质谱，产生的优化模型可用于后续17例试验样本的鉴定或诊断。
结果
布鲁克·道尔顿公司的CLINPROT系统的样品制备基于磁珠技术。从复杂生物材料（如血清、尿液或脑脊髓液）中捕获多肽和蛋白质并浓缩在磁珠上。从磁珠上洗脱的结合分子可用于MALDI-TOF-MS检测，而无需进一步纯化。不同功能的磁珠可富集不同的多肽和蛋白质，从而增加了可发现的生物标志物的数量。此次研究中，选用了3种不同的功能磁珠（MB-HICC8, MB-WCX, MB-IMAC Cu）产生蛋白质组表达谱。利用MB-HIC C8的疏水层析法进行捕获和浓缩，而MB-WCX是一种弱阳离子交换剂，而MB-IMAC Cu则利用了金属离子的亲合力。
磁珠技术的操作过程很简单，易于规模使用，并且可利用一台如图2所示的液体处理仪器而实现自动化。
图2为利用MB-HIC、 MBWCX和MB-IMAC Cu纯化EDTA样本后获得的MALDI-TOF质谱图。图谱中分别显示出的150多个峰值，其信噪比为3.0。
为检测磁珠及MALDI-TOF方法的重复性，将1例淋巴癌患者中提取的EDTA-血浆分离成8份，每份分别使用MB-HIC C8试剂盒分离，为防止操作人员对该结果产生影响，此环节由CLINPROT机械臂自动操作。，MALDI-TOF图谱自动采集，结果表明，该图谱具有高度可重复性，如图3所示，显示出磁珠的富集过程非常适用于临床蛋白组学。
图4：ClinProTools展示出预备数据组60例质谱的模拟凝胶图。通过MG-HIC C8富集特异蛋白质和多肽的。图5中详细展示了框图标识的区域。
图5：ClinProTools展示出的预备数据组的分层示图。重点体现出差异性的质谱区域，峰值为m/z6458。由于接近另一条非主要的峰值区域，该差异值只能通过重点扩大所关注的质谱区域才能可视。
ClinProTools可通过不同的模式展示相对可视的质谱，如密度示图、分层示图或轮廓示图。图4的模拟图是质谱的模拟2D胶示图，带和相应的峰强度是成比例的。由于人工比对十分费力且不实用，就需要生成反应差异表达峰的分类预测模型。ClinProTools提供了高度复杂和精密的运算法，可用以生成这种分类预测模型。本研究中，三种磁珠功能分别得出的预备数据组可利用基因算法独立生成模型。
通过MG-HIC C8富集之后，ClinProTools得出了最适宜的区分模式模型，该模型包括了4个相关峰：2438 m/z、 6458 m/z、7771 m/z 和9421 m/z。表1的峰面积统计表明，对照组（1类）和急性淋巴性白血病病例组（2类）峰面积具有显著差异。该质谱突出一个与模型相关的峰，就是图5中显示出的6458 m/z。由于邻近有一个较亮的6435 m/z峰值区域，如不放大此差异峰值区域则很难看到。因此在图4的模拟图中两个峰值区域均未显示出来。
利用可完全区分急性淋巴性白血病患者和健康对照人群的蛋白质组表达谱模式，从17个不明EDTA血样中诊断出1例病例，而且此模型正确地分辨出了7例急性淋巴性白血病病例，另外10例对照病例也被正确识别。
结论
基于磁珠富集是一个在蛋白质组表达谱研究中制备样品的强有力工具。
利用CLINPROT机械臂、基于磁珠制备样品，产生的质谱具有高度重复性。
利用ClinProTools软件，比较两个试验组，可揭示用于分类鉴定的生物标志物。
用于发现生物标志物模型的确认证实了分类预测模型的可靠性。
表1：根据ClinProTools显示出的P值进行峰面积分类统计。表中粗体文字为最适宜的分类预测模型显示出的峰值。1类：对照组；2类：急性淋巴性白血病病例组。
参考文献
[1] E.F. Petricoin, A.M. Ardekani, B.A. Hitt, P.J. Levine, V.A. Fusaro, S.M. teinberg, G.B. Mills, C. Simone, D.A. Fishman, E.C. Kohn, L.A. Liotta, The Lancet 359 (2002) 572-572.
[2] J. Villanueva, J. Philip, D. Entenberg, C.A. Chaparro, M.K. Tanwar, E.C. Holland, P. Tempst, Anal. Chem. 76 (2004) 1560-1570.
作者：
Elke Sch?ffeler1, Ulrich Zanger1,
Matthias Schwab1, Michel
Eichelbaum1 , Martin Stanulla2,
Martin Schrappe2, Thomas Elssner3,
Kristina Fahr3 and Markus Kostrzewa3
1Dr. Margarete Fischer-Bosch-
Institut für Klinische Pharmakologie,
Stuttgart, Germany
2Kinderklinik der Medizinischen
Hochschule, Hannover, Germany
3Bruker Daltonik GmbH
