RAPD标记技术
实验概要
运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(randomly amplifiled polymorphic DNA,随机扩增的多态性DNA.)该RAPD技术建立于PCR基础上，它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为十聚体)为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增,聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反应了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对于任一特定的引物，它同基因组DNA序列有其特异的结合位点，这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段。因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺失或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测，即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大，虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。
主要试剂
不同来源的植物DNA（50ng/μl）。
1． 随机引物（10mer）（5μmol/L） 购买成品。
2． Tap 酶 购买成品。
3． 10×PCR缓冲液。
4． MgCl2 25mmol/L。
dNTP 每种2.5mmol/L。
实验步骤
（1） 在25μl反应体系中，加入
模板DNA 1μl（50ng）
随机引物 1μl（约5pmol）
10×PCR缓冲液 2.5μl
MgCl2 2μl
dNTP 2μl
Tap 酶 1单位
加ddH2O至 25μl
混匀稍离心，加一滴矿物油。
（2） 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃2分钟，然后循环:94℃1分钟，36℃1分钟，72℃1分钟，共40轮循环。
（3） 循环结束后，72℃处理10分钟，4℃保存。
（4） 取PCR产物15μl加3μl上样缓冲液(6×)于2%琼脂糖胶上电泳，稳压50～100V(电压低带型整齐,分辨率高)。
电泳结束，观察、拍照。
注意事项
1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。
2、特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。
3、模板浓度不能太稀，而且需要纯化。
