RAPD分析技术-1
1 导论
聚合酶链式反应（PCR）以其优越性极大地影响到了分子生物学的几乎所有领域，并以其基本程序和DGGE（denaturing gradient
gel electrophoresis），开发出多种检测核苷酸变异的方法。 RAPD（Random Amplifed Polymorphic
DNA）就是其中的一种，它是1990年美国杜邦公司科学家 J. G. K. Williams和加利福尼亚生物研究所J.
Welsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。Williams称之为 RAPD，Welsh叫它AP-PCR（Arbitrary
Primer PCR）（Welsh J et al, Nucl Acids Res, 1990(18):7213; Williams J G K
et al, Nucl Acids Res,
1990(18):6531）。与常规PCR相比，RAPD主要有以下的自身特点：①无需专门设计RAPD扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9～10个寡核苷酸。②每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。③退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。④较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。
RAPD作为单引物的PCR扩增产物，其产生机理是引物首先结合到模板链，沿模板5’端方向延伸而产生不同长度的DNA片段，然后以这些片段为模板继续大量扩增。由于RAPD反应中，在3’端没有相应引物和模板互补，这样必然存在一个由引物沿模板DNA
5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互补序列的过程。有人提出，在RAPD反应过程中，扩增可能存在一些这样的分子模式：①5’端带有引物的单链DNA分子在3’端发生折转、自身结合和延伸，并在3’端形成同一引物的互补序列，变性展开后即可成为单引物PCR扩增的模板分子。②通过两条5’端各带同一引物的单链DNA分子拼联来实现。③对基因组DNA分子的颠倒重复序列而言，如果引物的结合位置正好处于这些序列的3’端，那么在其DNA片段的两条单链上就分别具有一个引物的结合位置和它互补的序列，成了RAPD扩增的模板分子。在双引物通用PCR中这种情况很少，但由于RAPD所用引物短，又在低温下退火，这增加了引物和颠倒重复序列结合的机会，完全有可能产生RAPD。
2 试验条件
【药品试剂】
模板DNA（10～100ng）
寡核苷酸引物（20mmol/L贮存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司购买，也可以自己合成）
0.2 mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等）
Taq DNA 聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）
10×PCR缓冲液（500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris·HCl, pH 8.3）
矿物油
电泳所需试剂
【仪器设备】 (生物秀实验频道——专业生物实验中心 www.bbioo.com)
PCR扩增仪
电泳装置
微量离心机
微量移液器（1～20ml和20～200ml）
0.5 ml Eppendorf管
紫外线观察装置及照相设备
3 操作程序
（1）在冰里向无菌的Eppendorf管中加入以下反应物：
水 14.75 ml
10×缓冲液 2 ml
10×dNTPs 2 ml
引物（20 mmol/L） 0.2 ml
Taq DNA聚合酶
终体积
DNA（10～100ng） 1 ml
石蜡油 20ml
（2）93℃反应2 min后开始如下循环：
93℃ 变性反应1min
36℃退火反应1min
72℃延伸反应1.5min
经过45个循环后，最后一个循环72℃增加5min，循环结束后反应产物置于4℃保存。
（3）20ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。
4 应注意的问题及其解决方法
（1）扩增偏差或无扩增。
――在部分或全部管中缺少一个组分。重复少量几个反应以确定所有的PCR组分是否都已加入。
――PCR抑制物可能与DNA一起纯化，改变DNA的浓度。
――在DNA分离中加入一个清洗步骤（如苯酚抽提）。
――稀释新的DNA溶液。
――引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物浓度。
――延长退火时间（在 PCR程序中的第二部分），或降低升温转换步骤之间的速率。
――提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。
――补加新的组分，该灭菌的都高压灭菌。
