ISPCR扩增的产物的杂交和检测实验
| 实验材料 | 探针 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | SSC SDS 显影液 定影液 苏木精 PBS AEC 封阻液 NaCl Tris·Cl 二甲基甲酰胺 BCIP NBT 乙醇 |
| 仪器、耗材 | 培养箱 盖玻片 载玻片 干燥剂 加湿盒 |
| 实验步骤 |
1. 配如下杂交混合液
（1）2 μl 200 pmol/l 探针（终浓度4 pmol/l）
（2）50 μl 去离子的甲酰胺（终浓度50%）
（3）10 μl 20×SSC（终浓度2×）
（4）10 μl 100×Denhardt 溶液（终浓度10×）
（5）10 μl 10 mg/ml 经超声处理的鲑精DNA（终浓度1 mg/ml）
（6）1 μl 10%SDS（终浓度1%）
（7）7 μl 水
2. 加10 μl 杂交混合液于载玻片各样品孔中，样品孔中含有经原位PCR扩增的核酸。再于各孔上盖以盖玻片，放95℃加热块上加热5 min。
如用33P-标记探针：
4a. 移去盖玻片，在2×SSC中洗片5 min。
（1）依次浸于Kodak显影液，3 min
（3）Kodak Unifix 定影液，3 min
8a. 在室温下，2%Gills 苏木精染液中，温育2~3 min，对玻片进行复染。
如用通过过氧化物酶检测的生物素或地高辛标记探针：
5b. 加10 μl 100 μg/ml 的链亲和素-过氧化物酶溶液于载玻片各孔中，轻轻盖上盖玻片，置37℃温育1 h。
7b. 在暗处，加100 μl AEC工作液于载玻片各孔，37℃温育10 min，然后镜下观察，如颜色不够强，再延长显色10 min。
如用通过碱性磷酸酶检测的生物素或地高辛标记探针：
4c. 移去盖玻片，室温下，在2×SSC中冼片2次，每次浸洗15 min。然后加100 μl 封阻液于样品孔中，覆盖各孔表面，平放玻片于加湿盒中，室温下温育15 min。
6c. 用吸水纸接触载玻片边缘、吸去封阻液，每孔中加100 μl 按上步稀释好的结合物溶液，平放玻片于加湿盒中，室温下温育15 min。
9. 室温下，以0.2% Gills 苏木精（如用于过氧化物酶的显色）或1%核酸固红染液（如用基于碱性磷酸酶的显色）染片5 min，浸玻片于自来水中，换水数次。
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