3M大肠菌群快速检验测试片操作以及判读
一、测试大肠菌群 操作方法
1. 未开封时，冷藏于≤8℃（≤46℉），并在保存期内用完，高温度时，凝固水可以排除，包装物最好于室温启开。
2. 已开封的，将封口以胶带封紧。
3. 已启开的包装袋不要冷藏并于一个月内使用完。
4. 制备食物样品稀释液，称取或吸取食物样品，置入适宜的无菌容器内，如均质袋、稀释瓶、WhirlPak bag或者其他灭菌容器内.
5. 加入适量的无菌稀释液,包括Buffered peptone Buffer(IDF phopsphate buffer ,用0.0425g/L的KH2PO4调PH7.2) 、0.1%的旦白胶水(ISO方法6887) 、缓冲旦白胶水(ISO方法6579) 、盐溶液(0.85-0.90%)、bisulfite-free letheen broth或蒸馏水. 但不可用含有枸橼酸盐、bisulfite or thiosulfate的缓冲液. 因为它能抑止菌生长。
6、搅拌或均质样品.
样品的稀释液调PH6.6-7.2对酸性样用IN NaOH、碱性样用INHCI调PH。
7、将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜。
8、使用吸管将1ml样液垂直滴加在测试片的中央处。
9、细心将上层膜缓慢盖下，避免有气光泡产生，切勿使上层膜直接落下。
10、使用压板（平面底朝下）放置在上层膜中央处。
11、轻轻的压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。
12、拿起压板，静置至少1分钟以使培养基凝固。
14、可目视及用标准菌落计数器或其它的照明放大镜计数，并可参考判读卡计算菌落数。
15、可以分离菌落作进一步鉴定，即掀起上层膜，由培养胶上挑取单个菌落。
13、测试片的透明面朝上，可堆叠至20片。培养时间和温度因方法而有不同，最通用的认可方法是：
总大肠菌群
● AOAC官方方法986.33和989.10（乳/生乳和其它乳制品）
大肠菌群：32℃±1℃培养24±2h
● AOAC官方方法991.14（食品类）
大肠菌群：35℃±1℃培养24±2h
● NMKL方法（147.1993）
大肠菌群：37℃±1℃培养24±2h
● AFNOR认可方法3M 01/2-09/89A和B（除水生贝壳类动物外的所有食品）
大肠菌群：30℃±1℃培养24±2h
耐热的（粪）大肠菌群
● AFNOR认可方法，3M 01/2-09/89C（所有食品） 44℃±1℃培养24±2h。当提高培养温度时，培养箱应有一定的湿度是需要的。
二、测试大肠菌群 判读方法
Petrifilm ColiformTM Coliform测试片含有VRB培养剂 (Violet Red Bile)，一种冷水可溶性的凝胶剂和四唑翁(tetrazollium)指示剂，可增强菌落计数效果。表面覆盖的胶膜，可留住发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。
AOAC和FDA细菌学分析手册（RAM）规定大肠菌群为革兰氏阴性杆菌，发酵乳糖产酸产气。大肠菌群菌落在Petrifilm CC测试片上生长产酸，PH指示剂使培养基颜色变深，在红色菌落周围有气泡者，为大肠菌群细菌。
大肠菌群签定,在不同国家可以有变更
(见培养时间和温度部分提示).
AOAC确认的方法:
Total coliform= 69 (有气泡的菌落)
No growth=0
注意图2到图5培养基颜色的变化,随着coliform 菌数增多,培养基颜色变深,背景的泡(沫)
为培养基现象,不是大肠菌群生长结果.
Total coliform count=79
Petrifilm cc 测试片菌落数适宜记数范围是15-150,不要计算圆型培基外的菌落,因为泡棉上已不含选择性培养基.见圆圈1
Estimated total coliform count=220
测试片面积约为20cm2,当菌落数超过150个,为了估计菌落数可选择其中一个或数个有代表性菌落的小方格(1cm2)计算平均菌落数,在乘以20方向得到整个测试片上的菌落数.
菌落太多时需进一步稀释样品,方能获得准确计数.
TNTC(菌数太多无法计数)
Petrifilmcc测试片菌落无法计数时至少有下列现象之一.(1)很多小菌落(2)有许多气泡(3)培养的颜色深暗.
Acrual coun=4
当有大量的非大肠菌群细菌如假单胞菌属细菌存在时,Petrifilmcc测试片培养基颜色呈黄色.
Total coliform count=2
食物颗粒为不规规则形状,且不带气泡.
Total coliform count=8
气泡可有不同形状,气泡可使菌落撑散,使菌落轮廓似气泡,见圆圈1和2,人为的气泡可能是不当的操作所至,或是来自样品捏的气体,他们成不规则形状,且不与菌落相连接.见圆圈3.
例如,1-10示为不同类型气泡与菌落的连接情况,所有菌落应计数.
