离子细胞化学实验 ——钙离子细胞化学具体方法
离子细胞化学可用来显示细胞内离子定位分布，目前用得比较多的是显示细胞内钙的分布，通常需结合EDX能谱分析。细胞内钙离子分布是高度隔室化的，形成钙离子浓度不同的钙池，正常情况下，细胞内胞浆、线粒体、核等部位都有钙的分布；在大多病理情况下（如缺血、缺氧、中毒等），细胞内钙可升高，并且进入到细胞内的钙很多进入到线粒体内。细胞内钙离子细胞化学的原理是：首先用磷酸盐或草酸盐与钙离子反应，在原位形成沉淀，然后再用焦锑酸盐反应，替代磷酸盐或草酸盐形成焦锑酸钙，焦锑酸钙在电子显微镜下为电子致密物质。
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 实验步骤 | 1. 组织切成约 1 mm3 的小块，用 0.09 mol/L 磷酸钾（或草酸钾）-3％ 戊二醛（pH 7.3，用 0.1％～1％ KOH 调 pH）固定 4 h 以上，4℃。也有人推荐固定早期用微波照射，以加速固定液渗入细胞内部（关于微波照射使用情况参见有关章节）。 2. 固定后用 0.09 mol/L磷酸钾（或草酸钾）-4％ 蔗糖（pH 7.3）漂洗2～4 h，换液3 次。 3. 1.5％～2％ 焦锑酸钾-1％ 锇酸4℃ 固定 2 h。 4. pH 10 的蒸馏水漂洗 3 次×10 min，以洗尽残留的焦锑酸盐。 5. 脱水、包埋同常规，切片，染色或不染色。 6. 电镜观察。 展开 |
| 注意事项 | 1. 焦锑酸钾常温溶解很慢，加热至 90～100℃ 则可很快溶解。 2. 应用磷酸钾或草酸钾结果并不完全相同。一般心、肝、肾、脑等组织、血细胞及培养细胞都可以用。 3. 焦锑酸盐还能与钠、镁等离子反应，形成沉淀，因此需控制实验条件，使焦锑酸盐主要与钙反应，少或不与钠、镁反应，用 1.5％～2％ 焦锑酸钾 4℃ 反应较为合适（在此反应条件下的实验进行 EDX 能谱分析，结果表明沉淀中不含或极少含钠、镁）。 4. 焦锑酸钾渗透到细胞内速度很慢，如果组织用灌注固定，再用振荡切片机切成薄片，效果较好。 5. 细胞内有离子钙及结合钙，并且二者可以相互转换。从理论上讲，与磷酸盐（草酸盐）-焦锑酸盐反应的应为离子钙，但实际情况可能并非完全如此，部分结合得不是很牢固的结合钙也可能与磷酸盐（草酸盐）-焦锑酸盐反应形成沉淀。 6. 切片后染色，常规观察，可同一般染色。如果要做能谱分析，则不染色，必要时可在锇酸固定后再用 1％ 锇酸 2％ 亚铁氟化钾固定，以提高反差。 展开 |
| 其他 | 来源：《免疫组织化学实验技术及应用》 |
