细胞化学染色检验（一）
细胞化学是组织学的一个分支，是在细胞形态学的基础上研究细胞的生物化学成分,及其定位、定量及代谢功能状态的学科。在细胞形态学的基础上，运用化学反应的原理对血细胞内的各种生化组成及其代谢产物（酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。
细胞化学染色临床上主要用于：①辅助判断白血病的细胞类型。白血病的诊断以形态学为基础，但有时仅采用瑞式染色是难以判断白血病细胞的类型的。不同的细胞系列，其所含的化学物质成分、含量及分布各不相同，随着细胞的分化阶段及病理生理状态变化，这些物质的含量也会发生相应改变。因此根据细胞化学染色结果的不同，可推断细胞的所属系列。因此临床上细胞化学染色成为辅助诊断白血病必要的、有力的手段。②其他血液系统疾病的诊断和鉴别诊断。在病理情况下，血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变，据此可以辅助疾病的鉴别诊断。如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。③观察疾病的疗效和预后。当病理状况纠正后，血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变。④发病机制的研究。
细胞化学染色的基本步骤为固定、显示及复染。不同的细胞化学染色，步骤不同。
1、 固定
为了保持细胞结构及化学成分的不变，需要对细胞进行固定。根据染色的成分不同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖等变成不溶性物质。固定的方法有物理法和化学法，临床常用化学法固定。物理法包括干燥和火焰固定，化学法包括甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定。采用蒸气或液体固定。
（1）蒸气固定：甲醛是常用的固定剂，极易挥发、氧化，常用40％甲醛蒸气固定。方法为在封闭的玻璃器皿中加入40％甲醛，将涂片血膜朝下，固定5～10分钟。
（2）液体固定： 将涂片浸在甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定液中，也可将两种或两种以上固定液混合，如10％甲醛甲醇液，甲醛丙酮液等。
2、 显示 通过不同的化学反应，形成稳定的有色沉淀，显示出被检测的化学物质。常用的化学反应种类有以下几种：
（1） 偶氮偶联法：含萘酚的底物，在相应酶的作用下释放出萘酚，后者与重氮盐结合，偶氮偶联形成有色沉淀。重氮盐的种类有坚牢蓝紫酱GBC、坚牢蓝B、六氮偶付品红等。中性粒细胞碱性磷酸酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、酸性磷酸酶染色等。
（2） 联苯胺法：过氧化物酶染色采用此法。粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶（主要是髓过氧化物酶），能分解过氧化氢释放出新生态氧，使无色的联苯胺氧化形成有色沉淀。
（3） 普鲁士蓝反应：细胞内外的铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成亚铁氰化钾蓝色沉淀，如铁染色。
（4） 雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀物，如过碘酸－雪夫反应。
（5） 金属沉淀法：某些金属化合物有颜色，形成沉淀后可以显示相应的物质，如钙－钴法中性粒细胞碱性磷酸酶染色。
3、 复染
显色反应只是针对细胞中的特定物质，要显现细胞的形态还需要用其他染液对细胞进行复染。所选择的复染液染色的结果应使细胞结构清晰，且应与有色沉淀有明显的对比度。对细胞核着色效果较好的有中性红、甲基绿、苏木精、核固红、沙黄等，使浆着色较好的有伊红、刚果红、光绿等。
复染后首先观察正常应为强阳性的细胞，如过氧化物酶染色观察中性粒细胞是否强阳性，如该类细胞结构清晰，对比度良好，说明染色成功，可进一步观察计数其他细胞的染色情况。
影响细胞化学染色结果的因素众多，主要有：标本的制备和保存方式；固定目的和固定剂的选择；酶作用底物的特异性及其选择、酶反应的最适时间、温度和PH值；抑制物如NaF、酒石酸和活化剂如钙离子、镁离子的选择和控制；储备液和缓冲剂的制备及保存方法；阳性率和半定量积分的计算方法。每一步都必须力求精准，方能获得可信的结果。
细胞化学染色方法众多，常用的有过氧化物酶染色、苏丹黑B染色、酯酶染色、过碘酸－雪夫染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶和抗酒酸酸性磷酸酶染色、骨髓铁染色等。目前还发展了上述染色法在同一张标本上的双染色，可提高分型的准确率。下面介绍这几种染色法的原理和临床意义。
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一、过氧化物酶染色(Peroxidase，POX)
【原理】过氧化物酶(Peroxidase，POX)是广泛存在于生物体中的一类酶,大部分含有血红素，是一种结合蛋白。它可以催化H2O2或相关有机过氧化合物与有机、无机化合物的氧化反应。血细胞所含过氧化物酶主要为髓过氧化物酶(MPO)，MPO是一类糖蛋白，是人类中性粒细胞含量最多的蛋白质，约占细胞干重的3%～5%。用MPO
PHMPZE探针与正常人染色体中期细胞作原位杂交，证明MPO基因定位在染色体17q11～q22，为单拷贝基因。对HL60细胞系中MPO的生物合成和加工过程研究发现，最初产生的MPO是分子量为89，000的前体，有大、小亚单位各一个，对内糖苷酶敏感，无MPO活性，MPO前体还需进一步进入溶酶体，经蛋白切割后才能成熟并具有活性。这提示MPO前体转录时或转录后的加工缺陷可产生异常的MPO，使后者在早幼粒细胞发育过程中不能包装到嗜苯胺蓝颗粒中。在临床白血病研究中，用全长MPO
cDNA作探针进行RNA印迹法杂交，或用MPO cDNA探针作反转录聚合酶链反应(RT-PCR)或用原位杂交，证明AML表达MPO
mRNA，但ALL无一表达MPO
mRNA。在早期原始细胞尚无颗粒时可在核膜、内质网上发现其阳性物，此时在光镜下则难以识别出来，用电镜可观察到部分细胞显示阳性。髓过氧化物酶是嗜天青颗粒中一种溶酶体酶,主要存在于线粒体和溶酶体中，主其能是破坏生物氧化过程中有巨毒的过氧化物，使其放出氧，参加细胞内氧化还原过程，是一种与生物氧化有关的重要酶类。
1985年血液学国际标准化委员会(ICSH)推荐三种方法：二氨基联苯胺法(DAB染色法)；过氧化酶氨基-甲基卡巴唑染色法；二盐酸联苯胺法。二氨基联苯胺染色是常用的方法，细胞颗粒中的过氧化酶，能将过氧化氢中的氧释放出来，氧化二氨基联苯胺(DAB)，形成金黄色沉淀而定位于过氧化酶活性的部位。
【染色结果及正常血细胞反应】细胞质中无金黄色颗粒者为阴性反应。颗粒细小而稀疏为弱阳性，颗粒较粗分布较密集者为阳性反应；颗粒粗大密集为强阳性。
1． 原粒细胞POX 阴性或弱阳性反应，早幼粒细胞以下阶段随着细胞分化成熟而增强，中幼粒和晚幼粒细胞阳性物充满胞浆，少部分盖在细胞核上。
2． 嗜酸粒细胞POX呈强阳性。嗜碱性粒细胞阴性或弱阳性。
3． 原始单核细胞缺乏POX活性，呈阴性和弱阳性。幼稚单核细胞呈阴性或弱阳性反应，阳性反应物颗粒细小，散在分布于细胞浆与细胞核上。
4． 淋巴细胞、原始及幼稚巨核细胞、浆细胞、高雪氏细胞、尼曼－匹克细胞、组织嗜碱细胞、原红及幼红细胞POX阴性；网状细胞、海兰细胞POX 阴性或阳性。
5． 遗传性过氧化物酶缺乏症，除嗜酸粒细胞不受影响外，中性粒细胞与单核细胞POX缺乏或减低。
【临床意义】过氧化物酶染色是临床最常用和最有价值的鉴别白血病类型的细胞化学染色方法。主要用于急性淋巴细胞白血病（ALL）与急性非淋巴细胞白血病（ANLL）的鉴别。
1． 急性白血病时POX反应强弱顺序M3> M2b> M2a> M6(粒)> M4 >M1> M5>
HAL>ALL.急性淋巴细胞白血病和CLL
POX均为阴性。50年代至今有人主张POX<3%或<5%为ALL，随着免疫技术的发展，检测手段增多，提示我们POX阳性率低时，多考虑急性混合型白血病或未分化白血病（M0），后者利用电子显微镜可观察到细胞浆中有阳性小颗粒。
2． 急性粒细胞白血病时，白血病细胞常呈阳性，M2b
POX表现为强阳性，部分M2b中异常中幼粒细胞POX阳性物在细胞核的凹陷处聚集成团，呈团块状反应(图1)。急性早幼粒细胞白血病(APL)POX呈强阳性反应。阳性物深棕黄色充满胞浆，细胞外浆一般为阴性。有个别M3也表现出阴性，可能由于在转录过程中出现异常，如还有一部分呈现强阳性，这提示POX基因的表达并不完全丧失，可能是由于部分转录(transcribed)或产生了不稳定的无效RNA所致。
3． 急性单核细胞白血病时呈弱阳性或阴性。ANLL中Auer小体POX阳性。有人报道ANLL患者出现严重感染时中性粒细胞会出现POX缺乏。
