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新一代Nanoimager可轻松实现超分辨荧光成像

2020.4.29

近年来，随着活细胞体系单分子荧光成像技术的发展，膜蛋白单分子研究，特别是受体动力学的研究，已成为目前单分子研究领域中最活跃的研究方向之一。近几年发展起来的超分辨成像技术因其能够突破光学衍射极限，而比传统光学显微镜具有更高的分辨率和更高的定位精度。

英国Oxford Nanoimaging公司最新推出的超分辨荧光显微镜—Nanoimager，由牛津大学Achillefs Kapanidis教授团队经过8年时间研发而成，是全球第一台大视野单分子FRET显微镜，将以超强的分辨率在单分子示踪、活细胞成像、蛋白互作、3D成像等研究领域发挥重要作用。

Nanoimager主要技术特点

♦ 横向分辨率<20nm；纵向分辨率<50nm

♦ 稳定性：<1 μm/K的漂移；<1 nm (1 Hz to 500 Hz)振幅

♦ 支持同时双色成像和顺序四色成像

♦ 采用1级激光，使用安全

图1 Nanoimager 超分辨成像

Nanoimager采用PALM/dSTORM技术和光激活定位显微技术 (PALM) ，利用单分子定位算法并结合光学系统艾里斑的形状，以超高精度（纳米量级）获得荧光分子的中心位置，然后用CCD将其信号进行采集转化最终得到分辨率为20nm的超分辨图像。

Nanoimager主要应用案例

1、单分子FRET

FRET是一种两个荧光分子间非辐射性的能量转移方式，反映两者的分子间距（一般在2 – 10 nm的间距发生）。Nanoimager是世界第一台用于大视野单分子荧光共振能量转移(smFRET)的商业化仪器，其适用于smFRET的关键功能包括：同时双色成像；单分子散射光强度和总体平均的实时分析；视野中数千个单分子的高通量成像，以及用交替荧光激发 (ALEX) smFRET的功能来定量化学计量与FRET效率。图2是smFRET用于研究单个DNA霍利迪交叉的动力学。

图2 用smFRET检测霍利迪交叉(HJs)的实时构象变化

2、单分子示踪

Nanoimager可以在两个通道同时示踪细胞或者纯化物样品中的单分子 (图3)，并计算扩散系数。细胞中分子的扩散系数可以被示踪，如酶或蛋白可以通过药物和抗生素的反应来示踪。低扩散率可以表示标记分子与另一分子或结构的相互作用或相结合。

Nanoimager可以直接反映纯化样品中荧光粒子的扩散率和预估大小，具有敏感性 (单荧光分子级别) 和特异性 (双色标记可以显著降低检测杂质的可能性)。

图3 Nanoimager双色追踪单分子/粒子

3、更大视野的成像

Nanoimager的每个成像通道均有50 µm x 80 µm的大视野，且照明均匀，可以实现单分子或细胞的高通量成像并快速收集数据。图4显示了以10倍于其他技术的速度对突变的大肠杆菌细胞的不同表型进行成像。为了获得不同表型的可靠的结果，需要对大量细胞进行比较。使用具有大视野，能够自动对焦和自动获取数据的Nanoimager可以显著加快整个实验速度和通量。将大视野与超分辨成像结合是Nanoimager的独特优势。