体内哺乳动物骨髓细胞微核试验-2
7.31/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）
成分：磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 19.077g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.814g
加蒸馏水至 1000mL
配制：将上述两种成分溶于蒸馏水中。以pH试纸检验pH值。
7.4Giemsa应用液
取一份Giemsa染液与6份1/15mol/L磷酸盐缓冲液混合而成。临用现配。
8实验动物和饲养环境
小鼠是微核试验的常规动物。体重为25g ~30g。也可选用成年大鼠，体重为150g ~200g。
实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。
9剂量分组
一般取受试物LD50的1/2、1/5、1/10、1/20等剂量，以求获得微核的剂量-反应关系曲线。当受试物的LD50大于5g/kg体重时，可取5g/kg体重为最高剂量，一般至少设3个剂量。每个剂量组10只动物，雌、雄性各半。另外，还应设溶剂对照和阳性物对照组。常用环磷酰胺作为阳性物对照，剂量可为40mg/kg体重。
根据受试物的理化性质（水溶性和/或脂溶性）确定受试物所用的溶剂，通常用水、植物油或食用淀粉等。
10染毒途径和方式
染毒途径视实验目的而定，建议采用经口灌胃方式。采用30h两次给药法，即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h取材。
11试验方法
11.1骨髓的制取
动物颈椎脱臼处死后，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，擦净血污，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液。
11.2 涂片
将骨髓液滴在载玻片一端的小牛血清液滴里，仔细混匀。一般来讲，两节胸骨髓液涂一张片子为宜。然后，按血常规涂片法涂片，长度约2cm ~3cm。在空气中晾干。若立即染色，需在酒精灯火焰上方，稍微烘烤一下。
11.3固定
将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min。即使当日不染色，也应固定后保存。
11.4染色
将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染色10min ~15min，然后立即用1/15mol/L磷酸盐缓冲液冲洗。
11.5封片
用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。
11.6观察与计数
先用低倍镜，后用高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，再在油浸镜下计数。虽然不计数含微核的有核细胞，但需用有核细胞形态染色完好做好判断制片优劣的标准。
本法观察含微核的嗜多染红细胞。嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈淡桔红色。微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。
每只动物至少计数1000个嗜多染红细胞。微核率指含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率（‰）表示之。若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上微核，仍按一个有微核细胞计数。
12数据处理和结果判断
12.1数据处理
报告各组微核细胞率的均数和标准差，利用适当的统计学方法如Poinsson分布u检验比较受试物各剂量组与溶剂对照组的微核率。
12.2结果判定
根据OECD Guidelines for Testing of Chemicals的准则，如果受试物试验组与溶剂对照组相比，统计学上有显著性差异，并有剂量—反应关系则可认为微核试验阳性。
