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体外哺乳类细胞微核试验原理及注意事项（二）

2021.2.23

4）阳性对照
阳性对照物包括染色体断裂剂和非整倍体剂。加S9时，断裂剂可以选用环磷酰胺和苯并(a)芘；不加S9时，断裂剂可以选用阿糖胞苷、丝裂霉素C、甲磺酸甲酯和4-硝基喹啉；非整倍体剂只用于不加S9时，可以选用秋水仙素和长春新碱。
如果短期处理试验方案在S9存在和不存在两种条件下都选用断裂剂作为阳性对照，那么长期处理试验方案应该选用非整倍体剂作为阳性对照。如果选用的细胞本身具有代谢能力，则不需要另外添加S9，阳性对照应该同时使用断裂剂和非整倍体剂。
5）阴性对照
溶媒必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响组胞存活和S9活性。首选溶媒是培养液(不含血清)或水。使用水作为溶媒时其体积不应大于总体积的10%。DMSO也是常用溶媒，但终浓度不应大于1%。
6）空白对照
如果没有文献资料或历史资料证实所用溶媒无致突变作用时应设空白对照。

2.5试验步骤
1）细胞准备
将一定数量的细胞接种于培养皿(瓶)中，以收获细胞时，培养皿(瓶)的细胞未长满为标准，贴壁细胞一般以长到85%左右为佳。
2）受试物处理

应用方案一，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗细胞，加入无血清培养液及一定浓度的受试物(需代谢活化者同时加人S9 mix)，置于培养箱中3h~6h；结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞，加人含10%血清的新鲜培养液和cytoB，继续培养1.5个~2.0个正常细胞周期后收集细胞。
对于淋巴细胞，最有效的方法是在有丝分裂原(如PHA)刺激后44h~48h开始受试物处理，这时细胞开始进入分裂周期。
如果3h~6h短期处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无S9的长期处理试验，用cytoB和受试物处理细胞1.5个~2.0个正常细胞周期，在处理结束后收集细胞。
如果已知或怀疑受试物(如核苷类物质)可能影响细胞周期(特别是P53活性细胞)，则细胞收获时间应该再延长1.5 个~2.0个正常细胞周期。

应用方案二，与应用方案一处理方法相同，只是不加cytoB。
3）收获细胞与制片
每次培养都应单独收获细胞和制片，如果细胞混合液的分散度良好则不需要进行低渗处理。
a、消化
贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放人离心管以800r/min~1 000r/min的速度离心5 min，弃去上清液。悬浮细胞不需要消化，直接离心。.
b、低渗
加入0.075 mol/L氯化钾溶液2 mL，用滴管将细胞轻轻地混匀，放人37°C细胞培养箱中低渗处理 1 min~5 min.
固定
加入2 mL固定液，混匀后固定5 min以上，以800 r/min~1 000 r/min的速度离心5 min，弃去上清液。重复一次，弃去上清液。
c、滴片
加人数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。
d、染色
推荐用姬姆萨染色(5% ~10%姬姆萨染液，15 min~ 20 min),，也可用DNA特异性荧光染料(如: 吖啶橙或Hoechst 33258)。
如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂，可用荧光原位杂交(FISH)或引物原位标记等方法。
4）阅片
a、微核的判断标准：微核一般为圆形或椭圆形，直径不超过主核的1/3；与主核在一个焦点平面上，与主核的颜色、结构特征及折光性一致；与主核之间没有核物质相连，可以和主核有边界的重叠，但能看清各自的核膜。
b、应用方案一，每个剂量组至少分析2000个双核细胞，计算微核细胞率(一个双核细胞不论含有几个微核，都只算作一个含微核细胞)。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。对不规则的双核细胞(如两个核大小相差悬殊)和多于两个核的细胞不进行分析。
c、应用方案二，每个剂量组至少分析2 000个细胞，计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。

三、数据处理和结果判定

3.1 数据处理
数据按不同剂量列表，指标包括细胞毒性、观察细胞数、含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量组与空白对照组、阴性对照组(溶媒对照组)、阳性对照组的微核细胞率用适当的统计学方法(如X²检验)进行处理。

3.2结果判定
下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果；
a)受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义，并与剂量相关;
b) 受试物在任何一个剂量条件下，引起的微核细胞率增加具有统计学意义，并有可重复性。

四、试验解释
阳性结果表明受试物在该试验条件下可引起所用哺乳类细胞染色体损伤，微核细胞率增加。阴性结果表明在该试验条件下受试物不引起所用哺乳类细胞染色体损伤。评价时应综合考虑生物学和统计学意义。

体外微核试验试剂盒
北京汇智泰康针对体外哺乳类细胞微核试验开发体外微核试验试剂盒，本试剂盒提供了进行体外哺乳类细胞微核试验所需的主要试剂和细胞，快速检测受试物是否有导致染色体断裂和诱发非整倍体的情况，从而评价受试物的遗传毒性，试剂盒的使用可以大大节约实验人员的准备时间。

【产品组成】
5mL×32体系/盒。

组分	规格	数量	使用说明	保存条件
中国仓鼠肺细胞（CHL）	1 mL	1	贴壁生长	-70℃
S9混合物	1.2mL	1	冰浴融化
S9 PS 反应液	10mL	1	使用前混匀
S9 CS 反应液	0.5mL	1	使用前混匀
环磷酰胺（CP）（CAS：6055-19-2）	0.2 mL	1	使用前混匀
丝裂霉素C（MMC）（CAS：50-07-7）	0.1mL	1	使用前加入300 μL灭菌蒸馏水混匀
秋水仙素	0.2 mL	1	使用前混匀
细胞松弛素B（cytoB）	540 μL	1	使用前用无菌的1260 μL PBS稀释，混匀

【产品使用说明】

1、细胞复苏
收到试剂盒后，请尽快复苏细胞。
从-70冰箱取出细胞，于37℃水浴融化，离心，弃上清，用含10%牛血清RPMI 1640培养液（RPMI-10）中重悬细胞后，再次离心；弃上清，用RPMI-10重悬后接种于细胞培养瓶，于37℃二氧化碳培养箱中培养，后期细胞传代比例为1:3。

2、细胞准备
将处于对数生长期，贴壁生长良好的细胞用胰蛋白酶（ Trypsin-EDTA）消化处理制成细胞悬液，5mL/瓶接种于25cm²细胞培养瓶中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中加湿培养约24 h-48h。

3、染毒处理
吸去培养瓶中培养液，加入一定浓度的受试物、S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，于培养箱中处理3h。弃去处理液，使用PBS洗涤细胞2~3次，换液后，按1%的比列加入细胞松弛素B（如4.95mL RPMI-10+0.05mL cytoB）。具体试验方案见下表：

1）10%S9混合液配制

10%S9混合液配制（11mL）
S9混合物	1.2mL	现配现用。使用过程中，于冰浴条件下保存。试验结束后，剩余溶液应丢弃，不可重复使用。
S9 PS反应液	0.4mL
S9 CS反应液	补足至10mL

2）推荐染毒培养体系配制方案

处理方式	组别	培养液体积（mL）	S9混合液体积（mL）	受试物体积（mL）	溶剂体积（mL）	阳性对照体积（mL）
CP	MMC	秋水仙素
活化 3h	阳性对照	4.45	0.5	/	/	0.05	/	/
剂量1	4.45	0.5	0.05	/	/	/	/
剂量2	4.45	0.5	0.05	/	/	/	/
剂量3	4.45	0.5	0.05	/	/	/	/
溶剂对照	4.45	0.5	/	0.05	/	/	/
不活化 3h	阳性对照1	4.95	/	/	/	/	0.05	/
阳性对照2	4.95	/	/	/	/	/	0.05
剂量1	4.95	/	0.05	/	/	/	/
剂量2	4.95	/	0.05	/	/	/	/
剂量3	4.95	/	0.05	/	/	/	/
溶剂对照	4.95	/	/	0.05	/	/	/

3）推荐染毒培养体系配制方案

处理方式	组别	培养液体积（mL）	CytoB（mL）	受试物体积（mL）	溶剂体积（mL）	阳性对照体积（mL）
CP	MMC	秋水仙素
不活化 24h	阳性对照	4.90	0.05	/	/	/	0.05	/
剂量1	4.90	0.05	0.05	/	/	/	/
剂量2	4.90	0.05	0.05	/	/	/	/
剂量3	4.90	0.05	0.05	/	/	/	/
溶剂对照	4.90	0.05	/	0.05	/	/	/

注：24h染毒的阳性底物需将丝裂霉素C稀释5倍后再使用。由于CytoB使用DMSO溶解的，按照食品标准，阴性对照的有机溶剂含量不得超过1%，若受试物需用有机溶剂溶解，样品制剂的有机溶剂含量不得超过70%。

4、收获细胞及制片
用胰蛋白酶溶液消化细胞，加入0.075mol/L氯化钾溶液进行低渗处理，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1，可适当调整冰醋酸浓度，但不宜过大）进行固定并滴片，用吉姆萨染液染色，中性树胶封片，并于油镜下进行阅片，每处理组计数500个细胞中的增值指数CBPI和细胞复制指数RI，计算出细胞毒性；每一剂量组应分析不少于2000个核型相差不大的双核细胞，计算微核率。

5、数据分析计算