小鼠胰岛分离与纯化
实验概要
小鼠胰岛分离与纯化
实验步骤
一、准备工作：
1、小鼠：小鼠应该毛色光滑，并根据实验需要选择合适的性别及年龄。
2、准备试剂：Hanks液 、P型酶（Roche） 、FBS 、1640培养基（含7mM glucose 10%FBS）
3、准备器具：眼科剪1把 ，眼科镊（直）2把，动脉止血夹（75px）1个，显微止血夹（窄1.2mm）1个，烧杯1个（40ml），注射器1个（10ml），一次性静脉输液针1个（0.45x0.15），蜡盘1个，体视镜1台，15ml离心管若干，50ml离心管若干，150px培养皿若干，87.5px培养皿若干、弯折的10ml注射器针头若干。
注：以下操作都在超净工作台中进行，溶液都应放在冰上。
二、胰岛分离
1、配消化液和终止液：消化液0.5mg/ml（P型酶/Hanks液），
终止液:15%FBS的Hanks液(FBS含量高能减少胰岛粘附培养皿)。
2、处死小鼠：断颈法，并用弯折的10ml注射器针头将其固定在蜡盘中。
3、灌注胰腺：用显微止血夹将胆总管近肝端夹住，从近肠端的膨大处，利用静脉输液针向胰腺中灌注消化液（约2ml/只），至胰头胰尾头充盈即可。
（注：此步骤非常关键，针头必须始终平行于胆总管，以免戳破胆总管；注射过程应轻柔、缓慢，并用动脉止血夹夹住肠端，以防针头由于反作用力从胆总管中退出，以及消化液进入肠道。）
4、分离胰腺：用两把眼科镊小心、快速的分离胰腺，并将分离的胰腺至于15ml离心管中。
（注：此过程要迅速，尽量不要将脂肪当成胰腺分离下来，尽量避免胰腺上沾有较多的血液，以免终止酶的消化作用）
5、静置消化： 37℃水浴锅静止消化20min。
6、终止消化：先向消化好的胰腺中加入2~3ml终止液，稍稍用力晃散胰腺，没有大块的组织即可；然后将终止液加到10ml以上混匀，冰上静置1~2min待胰岛沉降；去上清，再加10ml左右的终止液重悬，静置1~2min；去上清，加6~8ml终止液重悬，分装到两个150px的培养皿中。（增加洗涤次数，减少腺泡细胞的数量，能加快挑取速度。）
三、胰岛纯化
1、在体视镜下，手动挑取胰岛至含1~2ml Hanks液的87.5px培养皿中，一般挑取2遍，暂时不挑取的胰岛至于冰上。
（注：胰岛在反射光下为不透明的乳白色致密细胞团，多为椭圆形，大小不一，直径约200~300um，肉眼可见。透射光下，胰岛为偏黄色的致密细胞团，此时腺泡细胞偏黑色。）
2、胰岛培养：将纯化好的胰岛培养在87.5px的培养皿中。
（注：如果不求数量，形态不好的胰岛最好不培养，以免分泌一些未知因子，影响整皿胰岛的状态。）
