DNA重组技术－酶切
实验概要
通过酶切获得可进行体外重组的载体和外源DNA
实验原理
DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用链接酶将其连接，构成新的DNA分子。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅱ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅱ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端， 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言， 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。
酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg λDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
主要试剂
λ DNA、EcoR I、质粒（pUC19）、无菌水、70％，100％酒精、3Mol/L KAc(pH5.2)、 ice、琼脂糖、溴酚蓝、TE 、TAE、EB、DNA marker.
主要设备
水浴锅(37℃)、灭菌锅、离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、移液枪一套、微波炉。
实验步骤
酶切反应
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。
反应体系 1. PUC 4ul (0.5ug/ul)
buffer 1ul
EcoR1 1ul (15U/ul)
H2O 4ul
---------------------------
Total 10ul
反应体系 2. λDNA 4ul (1.5ug/ul，0.4ug/ul)
buffer 1ul
EcoR1 1ul
H2O 4ul
----------------------
Total 10ul
37℃，2hr；终止反应 65℃ 10min。
注意事项
1、限制性内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
2、10x buffer工作浓度为1x，注意混匀。
3、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
4、酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。
5、如果反应较长时间而酶切体系又很小比如10微升，那么哪怕用PCR小管做反应，体积损失也会很大。采用石蜡油覆盖的方法可避免水分损失
甘油浓度提高而引起的星活性。& O; c$ } H8
6、混合：这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡。
