免疫筛选实验
基本方案
实验材料 | cDNA |
---|---|
试剂、试剂盒 | BHI 氯霉素 NaOH SSC 氯仿 异戊醇 TES SDS mRNA 甲硫氨酸 乙醇 乙酸钠 免疫沉淀缓冲液 |
仪器、耗材 | 转子 硝酸纤维滤膜 离心管 微量多孔洗涤仪 |
实验步骤 |
1. 往微量滴定板的每孔中加入250 μl 含适当抗生素的选择性BHI培养液,并分别接种独立的cDNA克隆,37℃温育过夜。
5. 将制得的约50 μg 质粒DNA溶于1.5 ml TE缓冲液中,移入15 ml无菌、带盖的玻璃培养管中。
8. 将0.45 μm 孔径的硝酸纤维素滤膜放在一个连于真空泵的多孔滤器上。
12. 将盛于无菌带盖的塑料管的含10~50 μg poly(A)+ RNA的0.3 ml 杂交液在70℃预热10 min。
18. 用无菌针挑去滤膜,往每个微量离心管中加入150 μl 饱和酚和150 氯仿/异戊醇,混匀,离心后将水相转移至无菌的微量离心管中。
22. 加入15 μl 免疫沉淀缓冲液和1 μl 未经免疫的血清,室温下温育10 min。
25. 加入40 μl 蛋白质悬液,于室温反应30 min,离心弃上滑。
26. 依次用1 ml 免疫沉淀缓冲液、1 ml 高盐免疫沉淀缓冲液和1 ml 水冼涤蛋白A-Sepharose微珠。
27. 用20 μl 2×SDS样品缓冲液重悬沉淀,沸水浴10 min。
29. 干胶并进行放射自显影曝光。
展开 |
-
仪器推荐
-
仪器推荐
-
仪器推荐
-
仪器推荐
-
仪器推荐