液相色谱耦联Q Exactive 台式轨道阱质谱仪分析利...（七）
图 11. 将利妥昔抗体还原、烷基化、胰蛋白酶切后，酶切后肽段的基峰色谱图。
图 12. 利妥昔单抗轻链和重链的氨基酸序列。黑色字母显示的氨基酸代表通过二级质谱图鉴定到的部分。绿色显示的序列是仅通过完整肽段一级全扫描数据鉴定到的。红色显示的是重链部分的两个氨基酸（AK），他们既不能用一级也不能用二级质谱鉴定到。对于轻链来说，最终的序列覆盖率是 100%（二级质谱鉴定覆盖率是 96%），对于重链来说是 99.5%（二级质谱鉴定的覆盖率是 98.8%）。重链中天冬酰胺301 表示糖基化位点。
对于重链，也可以根据完整肽段的准确质量数鉴定肽段GQPR。最后，根据二级谱图，含糖基化位点 Asn301 的肽段没有鉴定到其未糖基化的形式。而对其进行基于理论糖基化修饰的数据库检索则很成功。此外，很容易在全扫描谱图中检测到糖肽，可以看到不同的糖基化形式和不同的电荷态。由于存在特征峰，二级谱图上也很容易看到。
图 13. 糖肽氨基酸序列 297-305 (EEQYN*STYR, *=G0F) 的二级质谱图，其母离子是三价电荷。
插图显示的是在全扫描质谱图中二价和三价母离子的同位素分布。
图 13 显示的是一个含 G0F 肽的谱图举例，显示了完整母离子和用 HCD 裂解糖肽得到的典型裂解类型：质量数为204 的 hexonium 离子（HexNAc）和质量数为 366 的离子（Hex-HexNAc）以及阶梯式碎片离子：己糖（m/z 162）、N-乙酰基氨糖（203）和岩藻糖（146）。综合考虑基于所有肽段的一级全扫描和基于数据库搜索的二级质谱图，重链的序列覆盖率达 99.5%，只有两个氨基酸（ 氨基酸 343-344）没有检测到。
结论
在本研究中，我们提供一种新流程，结合快速色谱，利用两种规格的整体柱和高分辨 Orbitrap 质谱仪，对完整及还原利妥昔进行了分析，采用 AIF，Multiplexed HCD 自上而下的裂解，以及自下而上的分析方法进行序列验证。即使抗体的上样量低至 500 pg，我们仍可以得到高质量的质谱图，该数据证明了 LC-MS 仪器的高灵敏度。此外，为了分析还原型单克隆抗体，我们采用色谱的方法将抗体的重链和轻链分开，设置不同的分辨率对其进行检测。通过这个流程，我们可以测定完整抗体的分子量，对轻链和重链的氨基酸序列进行确认和验证，对该抗体不同糖基化形式的相对丰度进行鉴定和评价。
致谢
感谢 Daniel Purstinger 在样品制备过程中给予的帮助，感谢Remco Swart 提供本研究当中用到的 PepSwift 和 ProSwift 整体柱。感谢奥地利联邦经济、家庭、青年部和全国研发技术部提供的财政支持
参考文献
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