液相色谱耦联Q Exactive 台式轨道阱质谱仪分析利...（六）
为了评价使用 250×0.2 mm PepSwift 整体柱时仪器的检测限，采集了一系列进样量的 LC/MS 样品。将 50pg-20ng 的完整抗体从最低浓度开始注入色谱柱（图 8）。在序列开始之前和各样品之间运行两针空白样品，以排除残留的影响。通过这种方法，我们发现完整抗体的最低检测限是500pg，在进样量为500pg的时候，仍然可以得到较好的谱图，从谱图上可以看到完整抗体中丰都最高的糖型。需要指出的是，最低浓度的样品必须现配，分析前不能在自动进样器中存放数小时。
图 8. 用 250 mm×0.2 mm PepSwift 整体柱分析完整的利妥昔抗体，上样量为 -20 ng-500pg 一系列稀释浓度得到的一级全扫描质谱图。
在 50 mm×1 mm 内径 ProSwift 整体柱上，进样量为 30 ng和 150 ng 的时候，完整抗体都可以得到高质量的谱图（图 9），
根据 30 ng 的上样量，我们预测最低进样量在 5 ng-10 ng 之间，在此范围内仍然可以得到优质的谱图。
图 9. 用 50 mm×1 mm ProSwift 整体柱分析完整的利妥昔抗体，上样量分别为150 ng 和30 ng时的一级全扫描质谱图（左侧）和最高丰度电荷态放大图（右侧）。
接下来，我们试图进一步确认轻链和重链的序列，进行了两类自上而下的实验：在 HCD 池中进行全离子裂解（AIF），或选择轻链和重链的 5 个电荷态进行多重（5-plex）目标离子二级质谱实验。所有谱图都是在分辨率为 70000下采集。目标离子谱图的采集使用基于保留时间的质量数列表，包括先流出的轻链质荷比（保留时间 13.16 min：m/z 1536.96、1646.6、1773.3、1920.7、2095.4）和后流出的重链（ 保留时间 16 -20min：m/z 1584.6、1635.7、1684.7、1748.5、1810.9 ）。在这类实验中，内含物列表中的第一个电荷态被选择并送到 HCD 池中进行裂解，子离子储存在 HCD 池中，同时分离第二个电荷态送到 HCD 池，裂解并贮存在该池中，直到第 5 个电荷态被裂解。5 个单独分离和裂解步骤产生的所有离子被一起送到 Orbitrap 分析器中，产生一个单一的碎片离子谱图。
所有归为轻链的碎片离子（如图 10 所示）在 N- 和 C- 末端都有好的覆盖率，在序列的中间也有一些碎片离子匹配，最终的覆盖率为 28%，占理论碎片的 15%。对于重链来说，两种方法的裂解效率都不是特别好，约产生 20 个碎片离子，大多数都位于序列的末端。
为了进一步确认序列，采取了自下而上的方法，将蛋白进行还原、烷基化、并用胰蛋白酶进行酶切。图 11 显示的是酶切后肽段混合物的色谱图。对数据进行数据库检索，数据库由轻链、两个重链变异体以及胰蛋白酶四个条目组成，结果显示轻链的序列覆盖率达 96%，重链的序列覆盖率达 78.8%（图 12）。两个来自轻链的、较短的、没有检测到的肽段（LEIK 和 EAK）只能在一级质谱图中以完整质量数的形式检测到，而肽段 EAK 可以根据含漏切位点 的肽段EAKVQWK 所对应的准确质量数进行鉴定。综合二级谱图鉴定的肽段和完整短肽的准确质量数，轻链的序列覆盖率是 100%。
图 10. 根据通过 AIF 实验得到的碎片离子匹配利妥昔抗体轻链的序列覆盖率。鉴定到 17 个 b 离子和 50 个 y 离子，对应 15.7% 的理论碎片离子数。（426 个理论碎片离子中鉴定到 67 个离子）
