液相色谱耦联Q Exactive 台式轨道阱质谱仪分析利...（二）
其他实验均采用 Thermo ScientificTM NanoFlexTM 离子源进行，离子源上配置 15 cm 的 PicoTipR 喷雾针（New Objective，Woburn，USA；20 μm 内径，360 μm 外径，10 μm 针尖)，流速为 1 μL/min，电压为 1.5 KV。
详细方法设置见表 3。
表 3. 本研究所有实验用到的质谱参数
源内CID
源内 CID（SID）是一个 DC 补偿参数（0-100 eV），通常加在源内 DC 补偿电压上。源内 DC 补偿电压由三个电压组成：毛细管 DC，S-lens DC 和 S-lens 的出口透镜。通过设置源内 CID 参数来应用 DC 补偿电压，应用该电压会导致多极杆进样池内的分析物与仪器离子源区域残留的气体分子发生碰撞。
全离子裂解
全离子裂解（AIF）是裂解模式的一种，源内产生的所有离子由质谱仪的离子光学组件引导，在 C-trap 内累积，然后一起送入高能裂解池进行裂解。在这种情况下，四极杆的设置并不是选择某一特定母离子，而是采用所有离子均通过的模式（RF-only）。在分析完整蛋白时，这是一种非常有用的方法，因为不同电荷态往往有不同的裂解模式，因此并不容易预测哪一种模式最好。
数据分析
采用 Thermo ScientificTM Protein DeconvolutionTM 软件 2.0 版对一级质谱图进行去卷积。分辨率为 17500 时得到的完整抗体和完整重链质谱图，用 ReSpect ™ 算法去卷积。分辨率为 140000 时获得的完整轻链质谱图和分辨率为 70000时得到的自上而下的谱图用 Xtract 算法去卷积。为了鉴定完整抗体和还原后的完整重链的糖型，我们将已知各种常见糖型组合的分子量与测定分子量进行比较。
采用 Thermo ScientificTM Qual BrowserTM 仪器中的 Xtract 算法对自上而下的 HCD 和 AIF 质谱图去卷积。使用 ThermoScientificTM ProSightPCTM 软件 3.0 版本的单个蛋白质模式对碎片离子进行归属，碎片离子质量误差设为5ppm。
采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 软件 1.4 版本SEQUESTR 算法对胰蛋白酶酶切物的数据进行检索分析。数据库由三种蛋白组成：胰蛋白酶、轻链和重链的两个异构体（在 219 位为Ala 或者 Val）。母离子质量误差设为 10 ppm，碎片离子的质量误差设为 20 mmu。考虑四个可变修饰：烷基化（半胱氨酸）、氧化（甲硫氨酸）、脱酰胺（天冬酰胺，谷氨酰胺）、谷氨酰胺转换为焦谷氨酸，和 N，N- 二甲基化（赖氨酸）（仅与胰蛋白酶自酶切产物鉴定相关）。
结果与讨论
利妥昔单抗是拮抗 CD20 蛋白的 IgG1 类单克隆抗体，由两条轻链（213 个氨基酸）和两条重链（451 个氨基酸）组成。轻链和重链通过 12 个链内和 4 个链间的二硫键连接（图 1）。在该抗体两个重链的 Asn301 处有糖链结构。连接的糖链组成和长度是变化多端的，从而导致该分子具有微观异质性。作为一种生物药，保持不同糖结构的种类和相对丰度是发挥抗体疗效必不可少的。附着在抗体上的常见糖的命名如图2所示。
图 1. 人源IgG1 属的单克隆抗体利妥昔的分子结构示意图
