无创产前基因检测诊断Pallister -Killian综合征病例分析
Pallister -Killian综合征(PKS)属于染色体微缺失 综合征的一种,可导致患儿身体不同程度残疾､生长发 育迟缓或智力损伤等｡PKS的临床表现包括特征性颅 面畸形､先天性心脏缺损､膈疝､癫痫和皮肤色素异常 等[ 1]｡PKS较为罕见,诊断困难,产前筛查是预防PKS 患儿出生的有效手段[ 2]｡本研究通过无创产前基因检 测(NIPT)诊断了1例PKS,现将结果报道如下｡
1 临床资料
孕妇,27岁,孕2产1,孕18周,否认近亲婚配, 无遗传病家族史｡于外院行超声检查提示:胎儿先天 性膈疝,股骨､肱骨低于 M-2SD线,心脏移位至右侧 胸腔,肺动脉主动脉比值增大,心包积液,三尖瓣反流 (少量)｡因血清学产前筛查18 -三体综合征高风险于 本院就诊,18 -三体综合征风险值为1/266｡产科医生 咨询后,建议直接行羊水穿刺产前诊断,但孕妇因担 心羊膜腔穿刺风险,自愿选择 NIPT,在充分了解NIPT的优势与局限性后,签署知情同意书,并于孕 22周时进行检测｡
1. 1 NIPT 静脉采集10mL外周血,4℃下1 600× g离心10min,取上清液2mL分装后再次于4 ℃下 16 000×g离心10 min,获得的血浆继续进行游离 DNA 提取,剩余标本于-80℃保存备用｡标本DNA 检测合格后用PCR - free法进行文库制备,采用 Next - Seq CN500高通量测序仪(贝瑞基因公司)完成36bp 的单端测序,检测试剂盒为贝瑞基因公司生产的胎儿 染色体非整倍体检测试剂盒(可逆末端终止测序法), 测序深度为0.3×,并进行生物信息学分析｡NIPT结 果提示:13､18､21 -三体无异常,但存在12号染色体短 臂部分重复dup(12)( p13.33 -p11.1), Z值为20.81,起 始位置为chr12:200000 - 34499999 ,片段大小为34.3 Mb,代表12号染色体短臂部分三体,见图1,需行进 一步的有创性诊断确诊｡
1. 2 胎儿羊水细胞染色体核型分析 经产科医生咨 询,签署知情同意书后,于孕24周时行羊水穿刺｡抽 取羊水30 mL,取10 mL用于高通量测序,其余20 mL分2管,以2 000r /min离心10min后弃上清,取 沉淀细胞,加适量羊水细胞培养基,接种于无菌培养 瓶内,置于37℃､含5%二氧化碳的培养箱中静置培 养8~9d,常规收获制片｡以G显带染色制备染色体 标本,对每例标本均按照《人类细胞遗传学国际命名体制(2013)》标准,计数20个中期分裂相细胞,分析5 个核型｡胎儿羊水细胞染色体核型分析结果:47, XX,+i(12)( p10)[58]/46,XX[42],说明该标本为12 号染色体短臂等臂染色体的嵌合体,见图2｡
1. 3 胎儿羊水高通量染色体拷贝数变异检测(CNV- seq) 提取羊水基因组 DNA,进行文库构建:通过片 段化-连接､PCR前纯化､PCR扩增､PCR后纯化等过 程,采用 NextSeq CN500高通量测序仪(贝瑞基因公司),进行 CNV-seq,测序结果经贝瑞基因公司Enli - ven? 变异注释系统标注｡CNV-seq结果为:dup(12) ( p13.33 -p11.1)(mos),提示该标本12号染色体 p13. 33 -p11.1处检测到拷贝数为3.5,片段大小为 34.70 Mb 的嵌合重复区域,起始位置为 chr12:160001 - 34860000,见图3､ 4｡经查阅数据库[包括 Deci pher 数据库､在线孟德尔遗传数据库 (OMIM)､ PubMed数据库及 UCSC Genome Browser数据库],得出该标本的变异包含了 PKS的全部区域,结合羊 水细胞染色体核型分析与 CNV-se q的结果,该标本 确诊为PKS｡
1. 4 孕妇及其配偶外周血染色体核型分析 为明确 变异来源,对该孕妇及其配偶进行了外周血染色体核 型分析,夫妻双方 G显带核型结果均未见异常,见图 5,说明胎儿染色体变异为新发
2 讨 论
PKS的细胞遗传学特点是特定组织中以嵌合体 形式存在的12号染色体短臂等臂染色体,故也称为 等臂12p综合征或12p四体综合征｡PKS的嵌合效 应是由于额外染色体上携带的基因最终导致颅面部､ 心血管､肾脏和其他系统异常｡PKS可累及体内所有 器官及系统,其典型临床表现如下:( 1)特殊面容包括 皮肤色素异常､粗狂面容､眼距宽､高腭弓､前额突出､ 短颈等;( 2)神经系统异常包括脑结构异常､癫痫､肌 张力减退;( 3)心脏缺陷包括心房和室间隔缺损;( 4) 胸部受累包括肺发育不全､膈疝;( 5)胃肠道表现包括 肠旋转不良及肛门移位;( 6)骨骼肌肉系统发育异常 包括PKS特有的生长模式,即在宫内提示明显的生 长过度现象,但在出生后立即表现为生长发育迟缓; ( 7)75%的 PKS患儿还有一定程度的视力损伤[ 2 -3]｡ PKS胎儿在妊娠中期超声检查中可显示出明显的异 常,包括羊水过多､膈疝､中枢神经系统异常､胎儿水 肿､颜面部异常､心室扩张､短肢畸形等｡当超声检查 提示羊水过多､膈疝､肢根骨短小,尤其伴有生长过度 时,应首先考虑PKS[ 4]｡本研究中该孕妇妊娠中期超 声检查提示:胎儿先天性膈疝,股骨､肱骨低于 M-2SD 线,心脏移位至右侧胸腔,肺动脉主动脉比值增大,心 包积液,三尖瓣反流(少量)｡符合PKS超声检查的 主要特征｡ PKS具有特殊的细胞遗传学特点,即异常的染色 体有组织特异性,通常在皮肤成纤维细胞中可以检测 到异常｡因此,由于嵌合体的组织特异性,PKS的诊 断可能经常被遗漏,并且通常在快速分裂的细胞,如 外周血淋巴细胞中不能检测到[ 5 -6]｡已报道的病例中 均未在外周血淋巴细胞中诊断出异常染色体i(12) ( p10) [ 7]｡据不同组织中期染色体核型分析统计,包 含有异常染色体i(12)( p10)的组织包括:淋巴细胞 (检出率为0%~2%)､成纤维细胞(检出率为50%~ 100%)､羊水细胞和骨髓细胞(检出率均为100%) [ 8]｡ 皮肤成纤维细胞中检测嵌合体的成功率高于外周血, 因为其异常细胞的损耗率低于 T淋巴细胞[ 9]｡本病 例羊水细胞中i(12)( p10)检出率为58%,说明CNV - seq技术可以精准地检测出比例高于5%的嵌合体,也 证明了在PKS的诊断方面,羊水细胞的检出率较高｡
羊水CNV-se q结果显示,12号染色体短臂重复,其拷 贝数为3.5｡一般来说,单纯的染色体重复检测到的拷 贝数应为3,但该标本是12号染色体短臂等臂四倍体 的嵌合体,所以导致其拷贝数为3.5｡目前,诊断PKS 的方法主要为细胞遗传学及分子遗传学两类,本病例 采用的细胞遗传学技术为染色体核型分析,其是染色 体检查的“金标准”;但由于 PKS特殊的细胞遗传学 特点,在不同组织中的检出率有很大差别,所以染色 体核型分析技术对PKS的检出率并不高｡本病例采 用的分子遗传学技术为CNV-se q,其不针对特定区域 设计探针,而是进行全基因组测序,覆盖了23对染色 体,精确度高,可检测到相对分子质量为100×10 3 以 上的染色体变异,并具有很好的重复性与拟合度,与 芯片技术比较,具有成本低､通量高､覆盖范围广及稳 定性更高等优点｡ PKS属于染色体微缺失综合征的一种｡染色体 的微缺失或微重复都属于染色体的拷贝数变异,可引 起微缺失或微重复综合征,导致患儿身体出现不同程 度器官功能异常､生长发育迟缓或智力损伤等[10]｡有 研究显示,有1.65%的孕妇在产前诊断中可检出有临 床意义的染色体微缺失或微重复[11]｡要想有效预防 出生缺陷,就需要进行大规模的产前筛查,并对高风 险人群进行产前诊断｡NIPT作为高通量测序在临床 应用最成熟的领域,其检测胎儿染色体非整倍体异常 已经成为临床产前筛查的重要部分｡2015年国际产 前诊断协会针对 NIPT出台了最新临床应用指南,明 确指出 NIPT 可对染色体微缺失或微重复进行检 测[12]｡近年来,随着测序技术的进一步发展,一些实 验室引入了染色体微缺失或微重复的无创产前筛查, 作为除了整个染色体非整倍体检测之外的另一种选 择,称之为扩展性的无创产前筛查技术[13]｡扩展病种 的无创性产前检测,筛查的范围扩大到全染色体基因 组7Mb的片段变异和常见的微缺失或微重复[14],但 目前并没有充足的临床应用反馈数据｡本研究中采 用 NIPT筛查出胎儿12号染色体短臂重复片段大小 为34.3Mb,并通过CNV-se q证实与胎儿有创产前诊 断结果相符,证明了 NIPT对检测染色体大片段的重 复有较高的灵敏度和特异度｡
综上所述,PKS是一种散发的罕见染色体疾病,具有复杂的临床表现及特殊的遗传学特征,临床上往 往容易漏诊,所以准确有效的产前诊断是避免缺陷患 儿出生,减轻患儿家庭和社会负担的最佳手段｡临床 上,在产前发现羊水过多､先天性膈疝､过度发育的胎 儿时应该高度警惕,同时建议孕妇完善产前诊断｡此 外,随着 NIPT技术的飞速发展,相信其在产前检测 领域将会做出更大的贡献｡
参考文献略｡
