蛋白质沉淀技术
蛋白质沉淀技术
| 实验步骤 |
一、AS 沉淀
1.原理
虽然有些其他盐类也可以用做沉淀剂，但是 AS 的特点突出，故而最具有应用价值。
AS 可很好地稳定蛋白质的结构、可溶性极好、相对价廉、纯物质容易获得，且 25℃ 时其饱和溶液的密度 (4.1InoVU1O=I.235 g/cm3) 低于另一种盐析剂磷酸氢二钾（3mol/L，(0=1.33 g/cm3)。
图 20.1 所示为典型的蛋白质溶解度曲线，是以蛋白质溶解度的对数对应 AS 浓度函数绘制而成。该曲线的特征是，在盐浓度较低的区域蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增大 (称为「盐溶」），而在盐浓度较高的区域蛋白质的溶解度随盐浓度升高而减小 (称为「盐析」）。该曲线后半部分可以通过等式 l 〇 g1DS=|3—Ks(r/2) 来描述。其中，S 为蛋白质在溶液中的溶解度，以 mg/mL 表示; 厂/2 为离子强度;j3 和 K3 为所涉及的蛋白质的特征常量。Ks 为盐析曲线的斜率, 而卩为盐析曲线外延至离子强度为〇时的蛋白质溶解度的对数值。一般地, 大多数蛋白质均具有相似的民值，而 p 值却有很大的区别。
假设图 20.1 所示曲线适用于目标蛋白质，并且其在细胞提取物中的浓度为 Img/mL。
最上方的水平虚线与溶解曲线交叉点为 logS=0(s=lmg/mL) 时 AS 的百分饱和度为 26%。这意味着若将 AS 增加到 26% 饱和度，所用的目标蛋白质都会溶解。若将 AS 增加到 32% 饱和度 (中间的水平虚线），l 〇 gS=_1(S=0.1 mg/mL), 将有 90% 的目标蛋白质会变得不可溶而析出。对于这种提取方法，一种较好的策略就是使 AS 达到 26%?
32% 的百分饱和度: 首先，使 AS 的百分饱和度达到 26%，选择分离出不溶性的物质，之后提高 AS 饱和度至 32%，并收集沉淀物，其中会含有 90% 的目标蛋白质。对于那些饱和度 26% 时沉淀以及在饱和度 32% 时无法沉淀的杂质蛋白质和细胞组分，可以通过沉淀去除。
建议考虑采用缓冲液将提取物稀释 1 〇倍。此时，目标蛋白质在提取物中的初始浓度为 0.Img/mL 或 logS=—l。提高 AS 的饱和度到 32%，目标蛋白质不会发生沉淀。为了获得 90% 目标蛋白质沉淀，应该提高 AS 的饱和度至 38%(下方的水平虚线) 或者采取 32%?38% 的 AS 饱和度区间。最终可能不得不将提取物稀释后，使用超过之前 10 倍量的 AS 来获取目标蛋白质。这说明限定提取物浓度是十分重要的。
目标蛋白质不一定具有如图 20.1 所示的溶解曲线，所以必须先进行下文所述实验确定适宜的 AS 浓度。
2.基本操作程序
在 AS 的应用方面有多种不同的操作方法，最常见的是向蛋白质提取液中加人固体 AS 以达到所需的百分饱和度。参考表 20.1 加人固体 AS 很方便, 且具有可重现性和实用性。
(1) 一般在较低百分饱和度时，目标蛋白质不会发生沉淀，而在较髙百分饱和度时会有 90% 以上的蛋白质析出。
(2) 加人固体 AS 以达到较低百分饱和度。高速搅拌的同时小心缓慢地加人 AS,
这样可以避免局部浓度超过目标值。有些人会采用研钵和研棒细心地将固体 AS 研磨成细粉状，以使其可以快速溶解。一旦 AS
全部溶解，就可以使沉淀持续 30 min 左右。这是一种折中的方法，既可以等待数小时使沉淀缓慢达到平衡,
同时又可以与纯化过程同步进行，并且不延误进程。通常应在一个小冰桶或冷室内进行所有的操作。
(3) 在一个预冷的旋转器中, 设置为 10000 心离心 10 min，以去除不溶性物质。
(4) 小心倒出上清液，并测量其体积。依据表 20.1 所示的以百分饱和度从低到高的顺序加入 AS 以确定所需 AS 的质量。继续伴以快速的搅拌并缓慢加入 AS，以避免局部形成较高盐浓度，之后静置 30 min, 使其形成沉淀。
(5) 如步骤 (3) 中所示进行离心。尽量去除上清液, 若之前已经仔细地进行了沉淀的预实验，则沉淀中会含有 90% 或更多的目标蛋白质。该蛋白质可溶解于适宜的缓冲液中，经过透析、脱盐和稀释后，便可用于下一步的纯化操作。
3.AS 沉淀实验的实施
一般地，提高 10% 的 AS 饱和度可以使 90% 目标蛋白质发生沉淀, 所以我们应该限制「AS 区间」的范围, 使其不超过 1 〇%(如蛋白质刚好在 30% 的饱和度溶解，但是在 40% 饱和度时发生沉淀，将此称为 30%?40% 的 AS 区间）。
如图 20.2 所示方法，仅采用两步离心操作便可以确定最佳 AS 沉淀条件。基本上，首先将细胞提取物置于一个容器中，如取 10 mL 样品分别加入到 5 个离心管中。依据表 20.1 向离心管中分别加人固体 AS, 使其饱和度分别达到 20%、30%、4 〇%、50% 和 6 〇%，静置 30 min 使蛋白质沉淀, 接着离心去除不溶性的物质。沉淀即分别为 20%、30%、40%、50% 和 60% 饱和度 AS 沉淀。测定相应上清液的体积，并再次加入 AS, 分别提高 10% 的饱和度。继续混匀后，使溶液静置 30 min, 待其沉淀后离心。所得的 5 份沉淀即为 20%?30%、30%?40%、40%?50%、50%?60% 和 60%?70% 的 AS 区间。再将其分别溶解于缓冲液，进行酶活力和总蛋白质含量的分析，必要时也可进行 SDS 凝胶分析。
仍具有活力的大多数蛋白质的大多数活力应在其中一个区间中。例如，30%?40% 区间活力为一半，40%?50% 区间活力为一半，那么
35%~45% 区间可能会是最佳 AS
浓度范围。虽然这种实验看起来显得比较絷琐，但是在沉淀步骤中确定可以富集更多蛋白质的最佳条件时，这无疑是一种十分有效的方法。
4.说明、问题、解决方法
(1) 得到的沉淀并不结实在离心之后，若 AS 沉淀形成得不结实，那么将很难将上清液完全倾出。一个简单的解决方法是将离心时间延长 50%，那么在离心管底部的沉淀物将会有更多的时间变得致密。松散沉淀物形成的另一个原因是其中存在 DNA，它增加了溶液的黏度，从而降低沉淀形成的速率。如是黏度的问题，一个方法是可通过更长时间的超声处理来破碎细胞, 使 DNA 被剪切成更短的片段来解决; 另一个方法是采用重组的核酸酶 Benzonase(EMD/Novagen) 进行处理。
(2) 在高浓度 AS 中形成球状悬浮物因为较髙浓度 AS 的密度与蛋白质聚集体的密度相当，所以通过离心处理后,AS 沉淀物可能会以悬浮物的形式存在，而不是以沉淀的形式存在于离心管底部。这很可能是因为蛋白质中含有部分脂类或者周围存在一些非离子化的去污剂与蛋白质结合使其密度降低。
(3) 很难按照已经发表的方案进行操作许多已经发表的方案并不是按照既定 AS 饱和度（在 0°C、20°C 或 25°C 时的饱和度) 或提取物的蛋白质浓度来进行的。因此需要注意的是，沉淀所需的 AS 量取决于蛋白质的浓度。
(4) 不得不中断 AS 沉淀步骤若须停止沉淀，可以将蛋白质保留在 AS 沉淀中。蛋白质在 AS 中是十分稳定的，析出蛋白质的悬液或沉淀都是如此。
二、PEI 沉淀
1.原理
PEI，其商品名称为聚乙烯亚胺 (polyminP)，它是由巴斯夫 (BASF) 生产的一种碱性阳离子聚合物，大量地用于纺织和造纸工业中。PEI 是通过乙烯亚胺的聚合作用得到的碱性多聚体，其结构为:CH3CH2N—(-CH2CH2—NH—X-CH2CH2NH2。经典 W 值为 700?2000, 相应所得到聚合物的分子质量为 30OOO?90OOODa。因亚氨基的 pKa 值为 10?11，所以在中性 pH 溶液中 PEI 带正电荷。采用;PEI 进行蛋白质分离起源于 Boe-hringerMannheim，Zillig 等 (1970) 进行了相关报道。将其用于蛋白质纯化的更多实例可参见几篇已发表的综述 (Burgess,1991;BurgessandJendrisak,1975;Jendrisak，1987;JendrisakandBurgess,1975)0 可以认为 PEI 类似于可溶的 DEAE 纤维素。PEI 可结合于带负电荷的大分子，如核酸和酸性蛋白质，进而形成 PEI 的网状结构，随后结合的酸性分子会快速形成沉淀。这种结合是以化学计量的方式进行的。较重的沉淀可以快速地形成，并可通过 5000r/min 离心 5 min 收集。酸性蛋白质是否可与 PEI 结合取决于盐溶液的浓度。在较低盐浓度 (0.Imol/LNaCD 时，微酸性的蛋白质会与 PEI 结合并形成沉淀，但是在中等盐浓度 (0.4mol/LNaCl)，它可以从多聚体上被洗脱下来，变得可溶。强酸性蛋白质在低盐浓度中会与 PEI 结合，但在中等浓度不会溶解，高盐浓度 (〇.9m 〇 l/LNaCl) 时才能被洗脱下来。应该注意的是，当蛋白质从 PEI 颗粒中被洗脱下来时，蛋白质和 PEI 本身都会变得可溶。所以, 在返回到低盐浓度前，需要将 PEI 从蛋白质中去除（参见本章 3.2?3.5 节)。
2.PEI 的不同使用方式
存在以下 3 种不同的 PEI 沉淀使用策略。
策略 A: 在高盐浓度 (Imol/LNaCl) 采用 PEI 沉淀。该方法会沉淀核酸, 同时几乎所有的蛋白质留存于上清液中。
策略 B(对于中性或碱性蛋白质而言）: 在〇.Im 〇 l/LNaCl 的条件下采用 PEI 沉淀，可去除核酸和酸性蛋白质。同时目标蛋白质留存于上清液中。
策略 C(对于酸性蛋白质，如 RNA 聚合酶): 这种方案将会在下文中进行详细的讨论，它是以 Burgess 和 Jendrisak(1975) 的方法为基础，并由 Burgess 和 Knuth(1996) 改善。
3.策略 C 的基本操作程序
(1) 配制 10%(V/V)[5%(m/V)] 的 PEI 储存液。PEI(WV) 常以 50%(m/V) 的黏稠液体状态存在（来自于 MPBiochemicals 的 PEI, 其相对分子质量 Mw=50000?
100000, 也可采用其他来源，如 Sigma 和 Aldrich，Mw=750000)。取 10 mLPEI, 用双蒸水 H2O 稀释至 70 mL，并以浓盐酸 (3.8?4.0 mL) 调节 pH 至 7.9。最后以双蒸水 H2O 定容至终体积为 1 〇〇 niL。储存液在冷室或室温下是稳定的。应该注意的是, 有些公司提供的 PEI 溶液已经用双蒸水 H2O 进行 I:1 稀释, 以降低溶液的黏稠度, 有利于溶液的配制。其浓度仅为 25%(m/\〇。
(2) 在 30 mL 含有 50 mmol/LTris-Ha(pH7.9)、5% 甘油、0.1 mmol/LEDTA、0.Immol/LDTT 和 0.15mol/LNaCl 的缓冲液中通过超声破碎?.cW 细胞 (约 3 g 的细胞沉淀物）。再以 15000r/min 离心 15 min 去除细胞碎片。所有的操作均在冰浴中进行。
(3) 将 PEI 沉淀实验应用于具体的体系 (如下所述)。例如, 加人 pH7.910%(V/V)PEI，使其终浓度为 0?3%(V/V)，混合 5 min, 直到形成稠密的白色沉淀物。
(4)5000r/min 离心 5 min。注意: 不要离心太实, 否则沉淀不易重悬。将〇.3% 的 PEI 上清液弃去，保存用于下面的分析。干燥沉淀物 1?2 min，尽量去掉残留的上清液。
(5) 用上述含有〇.4mol/LNaCl 的缓冲液 30 mL, 充分重悬 0?3%PEI 沉淀物。如果条件允许，可以采用 TissueTearor 勻浆器（BioSpecProducts,Inc.Cat#985370-07)，它可以很好地重悬沉淀物，有效地以物理形式洗掉陷入沉淀内的蛋白质，并洗脱与沉淀物 PEI 结合较弱的微酸性蛋白质。静置 5 min，接着以 5000r/min 离心 5 min，并倾出 0.4mol/LNaCl 的缓冲液。
(6) 用上述含有〇?9mol/LNaCl 的缓冲液 30 mL, 充分重悬 0?4mol/LNaCl 沉淀物。这种洗脱液中含有更多的酸性蛋白质 (如 RNA 聚合酶），但同时会使核酸留存于沉淀物中 (可采用 I.6md/LNaCl 洗去核酸)。静置约 5 min，混匀后以 15000r/min 离心 10 min。
(7)0.9mol/LNaCl 的洗脱液，需加入固体 AS 使其饱和度达到 60%(每 10 mL 加人 3.61 g)。持续混合至少 30 min 形成沉淀。以 15000r/min 离心 10 min。使沉淀物去水 5 min。该沉淀物中含有 AS 沉淀的蛋白质，而几乎所有的 PEI 都会留存于上清液中。但还是会有微量的 PEI 陷入到沉淀物中，通常不会影响下面的操作。如有必要更彻底地去除这些微量的 PEI，可以采用含有 60% 饱和度 AS 的缓冲液重悬该沉淀物，并再次离心。
这种操作程序一般可以使 RNA 聚合酶从其他蛋白质中得到 6 倍纯化，回收率大于 90%，在 1?2 h 内可去除几乎所有的核酸。
补充说明
⑴需着重强调的是, 从 0.9mol/LNaCl 洗脱液中去除 PEI 是必要的。如果仅采用稀释或透析的方法达到低盐浓度，蛋白质还是会与 PEI 结合, 并再次发生沉淀。
⑵我们发现，即使存在 1% 的 TritonX-100，PEI 沉淀还是会发生。
(3) 与 AS 沉淀不同，当用缓冲液 10 倍稀释提取物时，需要加人同样量的 PEI(如对于正常的提取物，用〇.3% 的 PEI 可以很好地沉淀目标蛋白质，而对于 1 〇倍稀释的提取物，仅需要加入〇.03% 的 PEI，便可以达到相同的沉淀效果，当然，所用的体积为提取物的 10 倍)。这表明 PEI 可以紧密地结合酸性组分，本质上即为对其进行滴定。
4.PEI 沉淀实验的实施
既然我们不能预测需要多少量的 PEI 才能沉淀某一酸性蛋白质，或者需要采用多大浓度的盐将蛋白质从 PEI 上洗脱下来，那么，建议还是先进行简单的 PEI 沉淀和洗脱实验 (BurgessandJendrisak,1975;BurgessandKnuth，1996)。基本上，该实验的步骤如下所述。将 6 个 200 样品分别装于 6 个微量离心管, 再加入 10%(VAZ) 的 PEI, 使其终浓度分别达到〇%、〇.l%、〇.2%、0.3%、0.4% 和 0?5%(V/V)。高速混合微量离心管 Imin。进行上清液的酶活性或 SDS 凝胶电泳分析, 如有需要, 还可采用 WesternBlot 检测沉淀所有目标蛋白质所需最小量的 PEI。我们假设其为 0.3%。接着，如上所述准备 6 个微量离心管，且每个离心管中均含有少量的 0.3%PEI 沉淀物，再加人 200JL1L 含有 0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L 和 I.0mol/LNaCl 的缓冲液。
充分重悬。静置 15 min，离心，如上所述分析上清液中的目标蛋白质。将不能洗脱任何蛋白质的最高盐浓度溶液作为清洗液，将可以洗脱所有目标蛋白质的盐浓度溶液作为洗脱液。
3.5 实例：采用 PEI 沉淀与 DNA 结合的碱性蛋白质最近，有研究者 (DuellmanandBurgess，2008) 设法纯化由 coZi 表达的强碱性蛋白质，爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原 (Epstein-Barrvirusnuclearantigen1，EBNA1)。我们在 0.1mol/LNaCl 的条件下，进行了 PEI 沉淀实验，以研究是否可以沉淀核酸和酸性蛋白质, 并将碱性的 EBNAl 留存于上清液中（采用策略 B)。意外的是，当加入少许 PEI(0.15%)，EBNA1 可以沉淀，但是当加人更多的 PEKO.4%) 却不能沉淀 EBNA1。这表明 EBNAl 与 DNA 已经结合，继而与 DNA—起被沉淀。但是，在更髙浓度的 PEI 存在时，PEI 会优先与 DNA 结合, 并置换出 EBNAl。我们发现，可以采用 0.15% 的 PEI 进行沉淀，0.3mol/LNaCl 进行清洗,0_8mol/LNaCl 进行洗脱。这样能够在使 EBNAl 得到很好富集的同时，还可以快速地去除核酸。
三、其他方法
本章已经着重讨论过 AS 沉淀和 PEI 沉淀。下述内容将会简单地论述用于蛋白质沉淀的其他方法，大量文献已详细描述了这些方法 [见 Englard 和 Seifter(1990);Ingham(1990)；Scopes(1994)]。
1.乙醇和丙酮沉淀
采用有机溶剂，如乙醇和丙酮进行沉淀处理，该方法已经有超过 100年的使用历史，但是最为大众所熟知的是 Cohen 和 Edsall 的经典研究成果，他们将其用于人血清蛋白质的分离。该沉淀方法的操作必须在较低的温度下进行，以避免蛋白质变性。
2.等电点沉淀
蛋白质在其等电点会变得不可溶，此时，它带有的净电荷为〇，且蛋白质分子之间的电荷排斥力相对最小，因而相互之间能够很容易地靠近。蛋白质在很低的离子强度下不易溶解，那么同样也可以在很低的盐浓度或无盐时进行等电点沉淀操作。
3.热沉淀
本方法中，将细胞提取物加热到一定的温度，此时许多蛋白质会发生变性而沉淀，但目标蛋白质因其更稳定仍会保持可溶性状态。该方法尤其可用于纯化表达的嗜热菌酶类，具体的操作可将细胞提取物加热到足够高的温度，使几乎所有的?：? 〇^蛋白质变性沉淀，而将热稳定的酶留存于溶液中。
4.聚乙二醇（非离子型聚合物）沉淀
本方法可参见 Ingham(1990) 的综述。
四、沉淀分离蛋白质的常规操作
(1) 在清洗或洗脱阶段，充分重悬蛋白质沉淀是十分重要的。虽然沉淀看起来十分结实, 但仍有大量的上清液陷人其中，且会附着于离心管的管壁。如之前所提到的一样，尽量干燥沉淀物以除去其中存在的上清液。如果沉淀比上清液量大，建议采用 10 倍体积的适宜缓冲液进行重悬，以去除陷人到沉淀物中的上清液蛋白质。例如，用 40% 饱和度的 AS 进行沉淀时，可采用 40% 饱和度 AS 重悬沉淀然后再次离心。清洗 PEI 沉淀是一个非常有用的步骤, 推荐采用与 TissueTearor 类似的匀浆器，可以将沉淀打碎并形成均匀的悬浮液。如果重悬不充分, 那么清洗步骤将不能起到有效的去除核酸的效果，且分离作用也会相应降低。
(2) 混合时应避免泡沫形成。若有空气混入蛋白质溶液中会促进蛋白质的氧化，同时在空气-水界面可引起蛋白质的变性。
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