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蛋白质沉淀技术（一）

2020.8.17

一、AS 沉淀

1.原理

虽然有些其他盐类也可以用做沉淀剂，但是 AS 的特点突出，故而最具有应用价值。

AS 可很好地稳定蛋白质的结构、可溶性极好、相对价廉、纯物质容易获得，且 25℃ 时其饱和溶液的密度 (4.1InoVU1O=I.235 g/cm3) 低于另一种盐析剂磷酸氢二钾（3mol/L，(0=1.33 g/cm3)。

图 20.1 所示为典型的蛋白质溶解度曲线，是以蛋白质溶解度的对数对应 AS 浓度函数绘制而成。该曲线的特征是，在盐浓度较低的区域蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增大 (称为「盐溶」），而在盐浓度较高的区域蛋白质的溶解度随盐浓度升高而减小 (称为「盐析」）。该曲线后半部分可以通过等式 l 〇 g1DS=|3—Ks(r/2) 来描述。其中，S 为蛋白质在溶液中的溶解度，以 mg/mL 表示; 厂/2 为离子强度;j3 和 K3 为所涉及的蛋白质的特征常量。Ks 为盐析曲线的斜率, 而卩为盐析曲线外延至离子强度为〇时的蛋白质溶解度的对数值。一般地, 大多数蛋白质均具有相似的民值，而 p 值却有很大的区别。

假设图 20.1 所示曲线适用于目标蛋白质，并且其在细胞提取物中的浓度为 Img/mL。

最上方的水平虚线与溶解曲线交叉点为 logS=0(s=lmg/mL) 时 AS 的百分饱和度为 26%。这意味着若将 AS 增加到 26% 饱和度，所用的目标蛋白质都会溶解。若将 AS 增加到 32% 饱和度 (中间的水平虚线），l 〇 gS=_1(S=0.1 mg/mL), 将有 90% 的目标蛋白质会变得不可溶而析出。对于这种提取方法，一种较好的策略就是使 AS 达到 26%?

32% 的百分饱和度: 首先，使 AS 的百分饱和度达到 26%，选择分离出不溶性的物质，之后提高 AS 饱和度至 32%，并收集沉淀物，其中会含有 90% 的目标蛋白质。对于那些饱和度 26% 时沉淀以及在饱和度 32% 时无法沉淀的杂质蛋白质和细胞组分，可以通过沉淀去除。

建议考虑采用缓冲液将提取物稀释 1 〇倍。此时，目标蛋白质在提取物中的初始浓度为 0.Img/mL 或 logS=—l。提高 AS 的饱和度到 32%，目标蛋白质不会发生沉淀。为了获得 90% 目标蛋白质沉淀，应该提高 AS 的饱和度至 38%(下方的水平虚线) 或者采取 32%?38% 的 AS 饱和度区间。最终可能不得不将提取物稀释后，使用超过之前 10 倍量的 AS 来获取目标蛋白质。这说明限定提取物浓度是十分重要的。

目标蛋白质不一定具有如图 20.1 所示的溶解曲线，所以必须先进行下文所述实验确定适宜的 AS 浓度。

2.基本操作程序

在 AS 的应用方面有多种不同的操作方法，最常见的是向蛋白质提取液中加人固体 AS 以达到所需的百分饱和度。参考表 20.1 加人固体 AS 很方便, 且具有可重现性和实用性。

(1) 一般在较低百分饱和度时，目标蛋白质不会发生沉淀，而在较髙百分饱和度时会有 90% 以上的蛋白质析出。

(2) 加人固体 AS 以达到较低百分饱和度。高速搅拌的同时小心缓慢地加人 AS, 这样可以避免局部浓度超过目标值。有些人会采用研钵和研棒细心地将固体 AS 研磨成细粉状，以使其可以快速溶解。一旦 AS 全部溶解，就可以使沉淀持续 30 min 左右。这是一种折中的方法，既可以等待数小时使沉淀缓慢达到平衡, 同时又可以与纯化过程同步进行，并且不延误进程。通常应在一个小冰桶或冷室内进行所有的操作。