蛋白质沉淀技术（三）
3.策略 C 的基本操作程序
(1) 配制 10%(V/V)[5%(m/V)] 的 PEI 储存液。PEI(WV) 常以 50%(m/V) 的黏稠液体状态存在（来自于 MPBiochemicals 的 PEI, 其相对分子质量 Mw=50000?
100000, 也可采用其他来源，如 Sigma 和 Aldrich，Mw=750000)。取 10 mLPEI, 用双蒸水 H2O 稀释至 70 mL，并以浓盐酸 (3.8?4.0 mL) 调节 pH 至 7.9。最后以双蒸水 H2O 定容至终体积为 1 〇〇 niL。储存液在冷室或室温下是稳定的。应该注意的是, 有些公司提供的 PEI 溶液已经用双蒸水 H2O 进行 I:1 稀释, 以降低溶液的黏稠度, 有利于溶液的配制。其浓度仅为 25%(m/\〇。
(2) 在 30 mL 含有 50 mmol/LTris-Ha(pH7.9)、5% 甘油、0.1 mmol/LEDTA、0.Immol/LDTT 和 0.15mol/LNaCl 的缓冲液中通过超声破碎?.cW 细胞 (约 3 g 的细胞沉淀物）。再以 15000r/min 离心 15 min 去除细胞碎片。所有的操作均在冰浴中进行。
(3) 将 PEI 沉淀实验应用于具体的体系 (如下所述)。例如, 加人 pH7.910%(V/V)PEI，使其终浓度为 0?3%(V/V)，混合 5 min, 直到形成稠密的白色沉淀物。
(4)5000r/min 离心 5 min。注意: 不要离心太实, 否则沉淀不易重悬。将〇.3% 的 PEI 上清液弃去，保存用于下面的分析。干燥沉淀物 1?2 min，尽量去掉残留的上清液。
(5) 用上述含有〇.4mol/LNaCl 的缓冲液 30 mL, 充分重悬 0?3%PEI 沉淀物。如果条件允许，可以采用 TissueTearor 勻浆器（BioSpecProducts,Inc.Cat#985370-07)，它可以很好地重悬沉淀物，有效地以物理形式洗掉陷入沉淀内的蛋白质，并洗脱与沉淀物 PEI 结合较弱的微酸性蛋白质。静置 5 min，接着以 5000r/min 离心 5 min，并倾出 0.4mol/LNaCl 的缓冲液。
(6) 用上述含有〇?9mol/LNaCl 的缓冲液 30 mL, 充分重悬 0?4mol/LNaCl 沉淀物。这种洗脱液中含有更多的酸性蛋白质 (如 RNA 聚合酶），但同时会使核酸留存于沉淀物中 (可采用 I.6md/LNaCl 洗去核酸)。静置约 5 min，混匀后以 15000r/min 离心 10 min。
(7)0.9mol/LNaCl 的洗脱液，需加入固体 AS 使其饱和度达到 60%(每 10 mL 加人 3.61 g)。持续混合至少 30 min 形成沉淀。以 15000r/min 离心 10 min。使沉淀物去水 5 min。该沉淀物中含有 AS 沉淀的蛋白质，而几乎所有的 PEI 都会留存于上清液中。但还是会有微量的 PEI 陷入到沉淀物中，通常不会影响下面的操作。如有必要更彻底地去除这些微量的 PEI，可以采用含有 60% 饱和度 AS 的缓冲液重悬该沉淀物，并再次离心。
这种操作程序一般可以使 RNA 聚合酶从其他蛋白质中得到 6 倍纯化，回收率大于 90%，在 1?2 h 内可去除几乎所有的核酸。
补充说明
⑴需着重强调的是, 从 0.9mol/LNaCl 洗脱液中去除 PEI 是必要的。如果仅采用稀释或透析的方法达到低盐浓度，蛋白质还是会与 PEI 结合, 并再次发生沉淀。
⑵我们发现，即使存在 1% 的 TritonX-100，PEI 沉淀还是会发生。
(3) 与 AS 沉淀不同，当用缓冲液 10 倍稀释提取物时，需要加人同样量的 PEI(如对于正常的提取物，用〇.3% 的 PEI 可以很好地沉淀目标蛋白质，而对于 1 〇倍稀释的提取物，仅需要加入〇.03% 的 PEI，便可以达到相同的沉淀效果，当然，所用的体积为提取物的 10 倍)。这表明 PEI 可以紧密地结合酸性组分，本质上即为对其进行滴定。
4.PEI 沉淀实验的实施
既然我们不能预测需要多少量的 PEI 才能沉淀某一酸性蛋白质，或者需要采用多大浓度的盐将蛋白质从 PEI 上洗脱下来，那么，建议还是先进行简单的 PEI 沉淀和洗脱实验 (BurgessandJendrisak,1975;BurgessandKnuth，1996)。基本上，该实验的步骤如下所述。将 6 个 200 样品分别装于 6 个微量离心管, 再加入 10%(VAZ) 的 PEI, 使其终浓度分别达到〇%、〇.l%、〇.2%、0.3%、0.4% 和 0?5%(V/V)。高速混合微量离心管 Imin。进行上清液的酶活性或 SDS 凝胶电泳分析, 如有需要, 还可采用 WesternBlot 检测沉淀所有目标蛋白质所需最小量的 PEI。我们假设其为 0.3%。接着，如上所述准备 6 个微量离心管，且每个离心管中均含有少量的 0.3%PEI 沉淀物，再加人 200JL1L 含有 0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L 和 I.0mol/LNaCl 的缓冲液。
充分重悬。静置 15 min，离心，如上所述分析上清液中的目标蛋白质。将不能洗脱任何蛋白质的最高盐浓度溶液作为清洗液，将可以洗脱所有目标蛋白质的盐浓度溶液作为洗脱液。
3.5 实例：采用 PEI 沉淀与 DNA 结合的碱性蛋白质最近，有研究者 (DuellmanandBurgess，2008) 设法纯化由 coZi 表达的强碱性蛋白质，爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原 (Epstein-Barrvirusnuclearantigen1，EBNA1)。我们在 0.1mol/LNaCl 的条件下，进行了 PEI 沉淀实验，以研究是否可以沉淀核酸和酸性蛋白质, 并将碱性的 EBNAl 留存于上清液中（采用策略 B)。意外的是，当加入少许 PEI(0.15%)，EBNA1 可以沉淀，但是当加人更多的 PEKO.4%) 却不能沉淀 EBNA1。这表明 EBNAl 与 DNA 已经结合，继而与 DNA—起被沉淀。但是，在更髙浓度的 PEI 存在时，PEI 会优先与 DNA 结合, 并置换出 EBNAl。我们发现，可以采用 0.15% 的 PEI 进行沉淀，0.3mol/LNaCl 进行清洗,0_8mol/LNaCl 进行洗脱。这样能够在使 EBNAl 得到很好富集的同时，还可以快速地去除核酸。
三、其他方法
本章已经着重讨论过 AS 沉淀和 PEI 沉淀。下述内容将会简单地论述用于蛋白质沉淀的其他方法，大量文献已详细描述了这些方法 [见 Englard 和 Seifter(1990);Ingham(1990)；Scopes(1994)]。
1.乙醇和丙酮沉淀
采用有机溶剂，如乙醇和丙酮进行沉淀处理，该方法已经有超过 100年的使用历史，但是最为大众所熟知的是 Cohen 和 Edsall 的经典研究成果，他们将其用于人血清蛋白质的分离。该沉淀方法的操作必须在较低的温度下进行，以避免蛋白质变性。
2.等电点沉淀
蛋白质在其等电点会变得不可溶，此时，它带有的净电荷为〇，且蛋白质分子之间的电荷排斥力相对最小，因而相互之间能够很容易地靠近。蛋白质在很低的离子强度下不易溶解，那么同样也可以在很低的盐浓度或无盐时进行等电点沉淀操作。
3.热沉淀
本方法中，将细胞提取物加热到一定的温度，此时许多蛋白质会发生变性而沉淀，但目标蛋白质因其更稳定仍会保持可溶性状态。该方法尤其可用于纯化表达的嗜热菌酶类，具体的操作可将细胞提取物加热到足够高的温度，使几乎所有的?：? 〇^蛋白质变性沉淀，而将热稳定的酶留存于溶液中。
4.聚乙二醇（非离子型聚合物）沉淀
本方法可参见 Ingham(1990) 的综述。
四、沉淀分离蛋白质的常规操作
(1) 在清洗或洗脱阶段，充分重悬蛋白质沉淀是十分重要的。虽然沉淀看起来十分结实, 但仍有大量的上清液陷人其中，且会附着于离心管的管壁。如之前所提到的一样，尽量干燥沉淀物以除去其中存在的上清液。如果沉淀比上清液量大，建议采用 10 倍体积的适宜缓冲液进行重悬，以去除陷人到沉淀物中的上清液蛋白质。例如，用 40% 饱和度的 AS 进行沉淀时，可采用 40% 饱和度 AS 重悬沉淀然后再次离心。清洗 PEI 沉淀是一个非常有用的步骤, 推荐采用与 TissueTearor 类似的匀浆器，可以将沉淀打碎并形成均匀的悬浮液。如果重悬不充分, 那么清洗步骤将不能起到有效的去除核酸的效果，且分离作用也会相应降低。
(2) 混合时应避免泡沫形成。若有空气混入蛋白质溶液中会促进蛋白质的氧化，同时在空气-水界面可引起蛋白质的变性。
