m6A RNA甲基化在发表多篇10+文章的运用（二）
为了进一步说明Mettl3在CRC糖酵解过程中促进肿瘤发展的作用，作者通过RNA-seq(云序可提供此服务)分析比较Mettl3
KO和野生型的细胞（WT HCT116 CRC）基因表达情况。通过GO和KEGG分析，WT
HCT116主要富集与葡萄糖代谢相关的信号通路，而Mettl3
KO细胞基因富集与糖酵解，葡萄糖反应物运输，糖异生等途径呈负相关。而进一步质谱代谢组学分析表明敲除Mettl3明显减少糖酵解途径关键成分的水平，如葡萄糖-6-磷酸，果糖-
1,6-二磷酸，丙酮酸和乳酸等。
图4. Mettl3参与CRC糖酵解过程
通过上面数据的分析，表明Mettl3可能介导CRC患者糖酵解代谢和癌变，因此可以确定以Mettl3作为CRC 糖酵解研究的关键RNA修饰酶。
（2）干预酶METTL3观察功能
为了进一步验证酶Mettl3的功能，通过敲除Mettl3后，乳酸（糖酵解的关键代谢物）的产生和葡萄糖的摄取均明显下降。为了弄清Mettl3的改变是否会直接影响糖酵解代谢，同时测量了CRC细胞的胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)，结果显示敲除Mettl3可显著降低HCT116和sw480细胞的ECAR水平，却不影响OCR水平。为了阐明Mettl3诱导的CRC糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，我们构建了Mettl3野生型(pcDNA3.1-Mettl3)和突变型(pcDNA3.1-Mettl3-mut，带有MTase结构域缺失)重组质粒。过表达Mettl3显著增加了乳酸的产生，葡萄糖吸收和ECAR水平。而且在CRC中，Mettl3的MTase结构域的缺失阻断了Mettl3诱导的糖酵解过程,
这些数据表明Mettl3通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。
图5. Mettl3驱动CRC中的糖酵解代谢
（3）干预酶METTL3观察细胞表型
进一步探索Mettl3对CRC细胞表型的影响，通过敲除酶Mettl3，一些关键的致癌基因表达受到抑制，如CDK1、PCNA、和CDCA7；观察到Mettl3敲除消除了细胞增殖、群落形成和肿瘤的生长；过表达Mettl3却促进了细胞增殖、群落形成和肿瘤的生长；并且使用2-DG(一种糖酵解途径的抑制剂)处理明显阻断Mettl3诱导细胞增殖和群落形成。这些结果表明Mettl3可能是一种肿瘤驱动基因，通过调控结直肠癌糖代谢促进CRC进展。
图6. Mettl3诱导的细胞存活依赖于糖酵解代谢
（4）m6A-seq & RNA-seq联合寻找酶靶点
通过关键酶的寻找和干预酶的功能，确定RNA修饰酶与肿瘤的联系，那么怎样寻找酶的作用靶点才是整篇文章的核心工作。作者这里利用m6A-seq和RNA-seq联合分析（云序可提供此服务）检测Mettl3敲除和WT
HCT116细胞RNA修饰和RNA表达情况。Motif分析GGACG与经典的m6A修饰基序“GGAC”相似，而且80%
Mettl3结合甲基化位点位于CDS区。与WT
HCT116细胞相比，敲除Mettl3后有2363甲基化位点明显下调，584甲基化位点明显上调。利用甲基化和转录组表达联合分析，找到甲基化水平下降，同时mRNA表达水平也下降，与糖酵解密切相关的靶分子-HK2和SLC2A1(GLUT1)。
图7. m6A-seq和RNA-seq联合分析
进一步通过靶分子HK2和SLC2A1进行表达水平（qPCR）、甲基化水平(MeRIP-qPCR)的验证（云序可提供此服务)，充分证实靶分子作为Mettl3直接调控CRC糖代谢的靶点。
图8 . 靶分子表达和甲基化水平验证
