分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

酶联免疫吸附剂测定（ELISA）检测抗生素残留

2021.11.29

酶联免疫吸附剂测定(ELISA)

ELISA 测定法是根据酶标记的抗体或抗抗体来进行的抗原抗体反应。由于酶的专一性催化作用,可使原来无色的底物通过水解,氧化或还原反应而显示颜色,所以该法的优点是:①可以通过颜色来快速做定性结果分析;②特异性强;③灵敏度高;④酶标板上一次可作多份样品检测。但 ELISA 检测法中对标记酶要求很高,应具备:①纯度高、溶解性高、特异性强、稳定性高;②测定方法应简単、敏感、快速;③与底物作用后会呈现颜色;④与抗体交联后仍保持酶的活性。最常用的是辣根过氧化物酶,它广泛存在于植物界,辣根中的含量尤高。HRP是一种糖蛋白,由酶蛋白和铁卟啉结合而成,相对分子质量为40000,其底物是二氨基联苯胺(DAB),DAB 经酶解可产生棕褐色沉淀物、因而可用目测或用比色法测定。此外,还有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和 β-D-半乳糖苷酶等可供应用。然而正因为有这么多的标记酶之间存在一定的差异,造成以标记酶生产出的各商品试剂盒间存在灵敏性差异。

1、基本原理

1971年 Engvall 和 Perlmann 发表了酶联免疫吸附剂测定(ELISA)用于 IgG 定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性;②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

2、方法类型和操作步骤

ELISA 可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。其中在抗生素残留中常用的是以下三种类型。

①双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下。

a.将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质。

b.加受检标本使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

c.加酶标抗体使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

d.加底物夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

②间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下。

a.将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原洗涤除去未结合的抗原及杂质。

b.加稀释的受检血清其中的特异抗体与抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去。

c.加酶标抗抗体与固相复合物中的抗体结合,从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体,可用酶标 IgG 抗体。

d.加底物显色颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法只要更换不同的固相抗原,可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
③竞争法竞争法可用于测定抗原,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下。

a.将特异抗体与固相载体连接,形成固相抗体,然后洗涤。

b.待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液,使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会,使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原,保温后,酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。然后洗涤。

c.加底物显色参考管中由于结合的酶标抗原最多,故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差,代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡,表示标本中抗原含量越多。

3、ELISA试剂盒举例

目前 ELISA 试剂盒已得到广泛宣传。现以 Randox 公司的 ELISA 试剂盒检测氯霉素为例做一介绍。

①原理本 ELISA 反应属“双抗体夹心法”。将样品和标有过氧化氢酶的氯霉素抗体结合剂加入酶标孔中,此孔壁预涂有纯化的氯霉素抗体。样品中的氯霉素将与孔壁上的抗体结合,然后将产生抗原/抗体复合物和抗原、过氧化氢酶标抗体复合物。冲洗后,加入一次性酶作用底物形成一个有色复合物,其颜色的浓度与样品中氯霉素的含量成正比。这时加酸停止反应,用分光光度仪在450nm 上读出结果。

②检测样品该试剂可用于定量测试牛奶、组织和尿液中所含氯霉素水平。

③样品准备

a.肌肉组织取样过程取3g 肌肉组织并加入6mL 醋酸乙酯,匀化1min;在2000r/min 的速度下离心15min;取出0.5mL 的上清液,将底物置于70℃的高温中温浴;将干燥后的物质溶于2mL 异辛烷-三氯甲烷(2:3)液体中,旋转1min;加入1mL稀释后的稀释/清洁缓冲剂,再旋转2min;如果此时是乳浊液,将其置于80℃的温度下温浴20min,直到出现分层。在2000r/min 的速度下离心10min,将其上清液加入酶标板。

b.肝脏/肾脏取样过程取3g组织加入3mL醋酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH5)中;加入8000单位的β-葡萄糖苷酸酶(玛瑙螺:Sigma G-0876)并匀化约30s;在37℃的温度下培养2h;加入12mL醋酸乙酯,并将其匀化1min;2000r/min下离心15min;取出上清液531mL,并置底物于70℃温浴;以后步骤同肌肉取样的后面步骤。

c.牛奶样品的准备脱脂牛奶可直接放入酶标板检测;半脱脂牛奶和全脂牛奶必须在2000r/min 的速度下离心15min,移去上面的脂肪层后方可进行检测。

d.尿液样品准备尿样品应在2500r/min下离心10min;用稀释后的稀释/清洁缓冲剂将尿液样品稀释10倍,如50μL 的尿液加入0.45mL 的缓冲液,均匀混合后即可进行检测。

④试剂的准备和稳定性

a.酶标板(12×8孔板)提供的酶标板可立即使用,有2～8℃的条件下储存,在保质日期以前均能保持稳定。如果只有一部分酶标板被使用,可将剩余的板放入有干燥剂的箔带里并重新封口,确保排除多余的空气。

b.稀释/清洗缓冲液用970mL 双蒸馏水将稀释/清洗缓冲液稀释,在2～8℃下可保持30天。

c.酶标抗体(标有过氧化氢酶的氯霉素抗体复合物) 酶标抗体提供给用户是浓缩的,必须按照另外一张单上说明在稀释后的稀释/洁缓冲液中得到稀释,稀释后的酶标抗体试剂必须立即使用。该试剂要避光存放。

d.一次性底物可直接使用,在2～8℃的温度下保存,在过期日期前质量稳定。不含有任何有害的有机溶剂。

e.牛奶缓冲液将一瓶牛奶缓冲液与10mL 双蒸馏水混合,在2～8℃的温度下可保存两天。
f.标准液在每瓶标准液加入2mL 稀释后的稀释/清洁液,静置至少30min,然后在使用前摇匀。重配的标准液在2～8℃的温度下可保存16天。

g.试剂盒未配的试剂硫酸(0.2mol/L)、β-葡萄糖苷酸酶(Sigma G-0876)、醋酸乙酯(分析纯)、氯仿(分析纯)、醋酸钠(分析纯)。

h.试剂盒未配的材料与仪器酶标仪(450nm)与37℃的水浴/培养箱、10～125μL 的移液器、酶标板密封纸。

⑤牛奶样品测定建议将所有需要用的试剂在测试前都被带到室温为19～25℃测试间,为减少交叉影响,建议将酶标板用粘性密封纸封住。每个测试做两套。建议用以下顺序来排列酶标板(每格代表两孔)。