Northern杂交操作步骤和DNA探针的制备与标记（2）
(4) 将1 ~ 2 μl RNA 上样缓冲液加到乙二醛化的RNA 样品中，然后马上把RNA样品加到凝胶加样孔中，留着两边最外面的两个孔不要加样。将RNA 相对分子质量标准参照物加到最外面的孔中。
(5) 以5V/cm 的电压进行电泳，直到溴酚蓝迁移大约8 cm。
(6) 将凝胶放在保鲜膜上，在紫外灯下观察RNA。把透明尺和凝胶对齐，在紫外灯下拍照。
(7) 在照片上量出从加样孔到各RNA 条带的距离。以RNA 片断大小的对数（log10）值对迁移的距离作用。用得到的曲线计算点杂交检测到的RNA 的大小。
(8) 利用半干转印系统把RNA 固定在固体支持物上。
变性RNA的转移和固定：
(1) 将凝胶转移至培养皿中，用锋利的刀片修去凝胶的无用部分，在凝胶的左上角切取一角作为标记。
(2) 将凝胶置于0.5×TBE中平衡30min。
(3) 用切纸刀裁一张长宽均大于胶1mm 的尼龙膜，切去膜一角，使其与凝胶的切角对应。
(4) 将尼龙膜和6 张与胶大小一致的滤纸置于0.5×TBE中平衡10min。
(5) 将3 张滤纸平铺于电转移装置的金属箔片上（阳极），用玻棒赶走所有气泡。
(6) 将已平衡的尼龙膜平铺于滤纸上，用玻棒赶走所有气泡。
(7) 小心将凝胶置于尼龙莫上，并使两者的切角相重叠，确保胶与膜之间没有气泡。
(8) 将另外3 张滤纸置于胶上，用玻棒赶走所有气泡。
(9) 于最上层加入约15ml转移缓冲液（0.5×TBE）以湿润滤纸。
(10) 将支持框至于胶/膜/滤纸四周，接上阴极电极，盖上安全盖，接上电源供给装置（确保电极插 头连接正确），给予3mA/cm2 的恒流，转移时间一般为30-35min（电转过程中，电压保持在20V左右，若超过25V，则须终止转移）。
(11) 电转结束后，用2×SSC 漂洗尼龙莫。
(12) 将尼龙莫置于一张干的滤纸上，在波长254nm 处按照0.120J/cm2 的剂量照射3min。
2. 杂交
1）试剂
DIG Easy Hyb
2）方法
(6) 将变性的DIG 标记的DNA 探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2膜）。小心
混匀，避免产生泡沫。
(7) 开泵排走预杂交液。
(8) 关泵，等到负压消失，加入上述探针/杂交液，温育至少6h。
开泵排走DNA 样品溶液（注意：每次开泵应完全抽走薄膜上的试剂）。注：杂交温度因
不同探针而异。
3. 洗脱
(1) 用2×SSC，0.1% SDS于15-25℃洗脱2次，每次5min。
(2) 用0.5×SSC，0.1% SDS 于65-68℃洗脱2 次，每次15min。
4. 显色
1）材料
DIG-labeled 核苷酸
2）试剂
(1) Washing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; ph7.5 (20℃); 0.3% (v/v)Tween20
(2) Maleic acid buffer: 0.1 M Maleic acid, 0.15M NaCl; 用NaOH（固体）调节pH到7.5 (20℃)
(3) Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, ph9.5 (20℃)
(4) TE buffer: 10mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8.0
(5) Blocking stock solution: 用Maleic acid buffer 将Blocking reagent 稀释为10%（w/v）
(6) Blocking solution: 用Maleic acid buffer 将10× Blocking reagent 稀释为1×working solution
(7) Antibody solution:每次使用前将Anti-Digoxigenin-Ap, 10000rpm 离心5min, 用Blocking solution将Anti-Digoxigenin-AP 稀释5000倍
(8) Color substrate solution: 于10ml Detection buffer 贮藏液中加入200μlNBT/BCIP(避光保存)
3）方法：
(1) 把杂交仪温度调至25℃。
(2) 杂交后按严格的步骤洗脱后，用Washing buffer 简单的清洗。
(3) 于100ml Blocking buffer 中保育30min。
(4) 在20ml Antibody solution 中保育30 min。
(5) 用100ml washing buffer 洗2*15min。
(6) 在20ml Detection buffer 中平衡2-5min。
(7) 在黑暗的合适的容器中，将膜于10ml 新鲜配制的Color substrate solution 中保育0.5h-16h (该过程不要摇动，可一段时间的暴露灯光下观察染色情况)。
(8) 当所需的颜色呈现时，用50ml 灭菌的双蒸水或TE-buffer冲洗膜。
