蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（八）
肽图分析法 - 蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南
反相高效液相色谱已成为蛋白质分析和表征的标准方法，尤其是治疗性药物的分析和表征。
反相色谱分析法分辨率高，检测灵敏度好，能够提供大量关于蛋白质的信息。
有些时候，蛋白质作为完整的分子分析，但更多的时候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸残基将碳骨架断开，从而将蛋白质裂解成小片段。
随后用反相高效液相色谱法对裂解产生的肽段进行分析。
该技术叫作肽图分析，是一种标准的蛋白质分析方法。
通过反相色谱分析蛋白质裂解后的肽段能够获得蛋白质的大量信息。
通过比较表达蛋白与参照标准蛋白的肽图能够得出蛋白纯度和表达的准确性。肽图通常作为蛋白质治疗药物的鉴定分析工具。
通过肽图可以确定蛋白质降解产物，如发生脱酰胺作用的天冬酰胺和氧化甲硫氨酸。
肽图可以确认或验证二硫键连接，以此得出蛋白质三级结构和疗效。
肽图能够确定糖基化（加入碳水化合物）位点，为详细鉴定连接在其上的寡糖提供了条件。
利用质谱检测得到的肽图为蛋白质鉴定、肽序列分析和数据确认提供了一种先进的手段。
在生物蛋白质组研究中，蛋白酶水解产物还用于蛋白质的鉴定和定量分析。
有许多蛋白水解酶都能断开蛋白质的碳骨架，通常作用于特殊氨基酸残基。包括：
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蛋白酶 |
特异性 |
特性 |
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胰蛋白酶 |
作用于赖氨酸和精氨酸的羧基端 |
平均每10~12个氨基酸产生一个肽。胰蛋白酶是最常用的蛋白水解酶。 |
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胞内蛋白酶 Lys-C |
作用于赖氨酸的羧基端 |
能够产生胰蛋白酶水解蛋白生成多肽的60~70%。Lys-C 的优点是在高达4M的尿素浓度中仍能保持活性。 |
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S.aureus V8 蛋白酶 |
作用于酸性氨基酸和天冬氨酸的羧基端。 |
为胰蛋白酶水解法提供补充信息。 |
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胞内蛋白酶 Asp-N |
作用于天冬氨酸的羧基端 |
为胰蛋白酶水解法提供补充信息。 |
胰蛋白酶是最常用的蛋白水解酶（蛋白酶）。以下为胰蛋白酶水解蛋白的五个阶段：（注：参考文献21详细回顾了胰蛋白酶的水解）
1、变性。要在合理的时间内完成蛋白质水解，必须对蛋白质作变性处理。高温下（37℃），将蛋白质置于6M 盐酸胍或8M 尿素等离液剂中，在中性pH值（~7.5）缓冲液下处理30分钟，蛋白质即可变性。
2、二硫键的还原。二硫键会阻止蛋白质的完全变性。
通常可通过在待水解蛋白的变性过程中加入浓度为~20 mM 的二硫苏糖醇（DTT）等还原剂将二硫键还原。
3、游离半胱氨酸的羧甲基化。如果还原性半胱氨酸保持游离状态，则有可能以错误的方式重新形成二硫键。
为了避免这种情况，可加入浓度为~60mM的碘乙酸等试剂，在37℃温度下处理30分钟，使游离半胱氨酸甲基化。该反应由100 mM DTT 退火。
4、脱盐。当溶液中存在尿素或胍盐时，水解反应无法进行，因为胰蛋白酶自身作为一种蛋白质会变性，失去酶活性。
尿素或胍盐必须通过离子交换或渗析去除或将浓度降低至1M以下。
5、胰蛋白酶水解。脱盐后，将蛋白质溶解在pH7.5~8.5（胰蛋白酶的最高活性pH）的缓冲液中——Tris或碳酸铵，并在20~100个待水解蛋白组分中加入一份胰蛋白酶，随后在低温至37℃的温度区间内处理蛋白质。
低温处理时间长达16个小时。在37℃下，水解可在1~4小时内完成，具体取决于蛋白质。
如果胰蛋白酶的时间、温度或相对浓度均过低，则水解将不完全，一些潜在裂解可能不发生，最终导致形成含赖氨酸或精氨酸的大分子肽。
如果胰蛋白酶的水解时间、温度或浓度均过高，则会发生胰蛋白酶自身溶解，产生“自溶产物”，即胰蛋白酶水解产生的肽段，从而造成混淆。
惯常的做法是忽略蛋白质，考虑胰蛋白酶。按照蛋白质完全水解的条件对得到的样品进行色谱分析，了解胰蛋白酶自溶的程度以及肽图中任何胰蛋白酶自溶肽产物的位置。
开发胰蛋白酶水解协议过程中，对胰蛋白酶和蛋白质的水解时间、温度和相对浓度进行了优化。
当利用肽图确定二硫键的位置时，必须在不还原二硫键的情况下水解蛋白。但在二硫键未被还原的情况下，许多蛋白质的水解速度非常慢。
在缺还原剂的情况下，如果水解速度很慢或水解不佳，可利用Lys-C代替胰蛋白酶，并在4M尿素中水解，维持水解过程中蛋白质的变性。
水解过程中有时采用表面活性剂维持溶液中的蛋白质，但表面活性剂会降低色谱分辨率，应尽量避免。
