GST融合蛋白表达与纯化的实验步骤与注意事项(二)
7、转化BL21(DE3)pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达
(1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根)
(2)2 ml离心管中,加入25μl BL21+ 3μl质粒(300-500ng),混匀(质粒≤感受态1/10)
(3)冰上放置30min
(4)42°C,90s
(5)冰上放置2-3min
(6)加入300μl LB(无抗生素)(相当于菌体10倍体积的LB),37°C,250rpm,1 h
(7)4000rpm,2min,弃上清,其余混匀以后涂平板(Ampr),37°C,过夜(16 h)
(8)挑单克隆菌落,5ml LB(Ampr),37°C,250rpm,过夜(16 h)
()稀释10倍、20倍、50倍测定OD600
()选择合适的稀释倍数,5ml菌液,37°C,250 rpm,1 h,测定OD600
(7)取100μl菌液加入5ml LB(Ampr)(50倍稀释),37°C,250rpm,过夜(16 h)
(8)取500μl菌液加入5ml LB(Ampr)(10倍稀释)(其余菌液4°C保存),测OD600
(9)37°C,250 rpm,2 h(OD600:0.6-0.8),测OD600
(10)室温放置20 min(摇床降温,30°C)
(11)取100μl作为诱导前对照,冰上放置
(12)菌液中加入IPTG,终浓度0.5-1 mM
(13)30°C,250 rpm,2 -4h(可做时间梯度),测OD600
(14)取100μl作为诱导后对照,连同诱导前菌液,12000rpm,离心2min,加入50μl 1×SDS上样缓冲液
(15)取4ml菌液,12000rpm,离心2min,收集到2ml离心管中
(16)加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体
(17)超声破碎细胞:超声20s,间隔10s,共3-5次,超声强度200-300W(冰浴)
(18)超声后菌液换入一个新1.5ml离心管,4°C,12000rpm,离心5min
(19)超声后上清:取25μl上清,加入25μl 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存)
(20)超声后沉淀:沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬,取25μl,加入25μl 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C保存)
(21)将四个样品煮沸3min,12000rpm,离心5min
(22)8-10%SDS-PAGE,30μl上样,顺序:诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀
(23)考马斯亮蓝染色
[注意]
(1)菌液OD值小于1即可
(2)诱导时间最好做一个梯度,2-6h
(3)诱导温度适当摸索,24°C、30°C
(4)IPTG浓度可做梯度,1mM
(5)超声条件可视实际情况改变,只要使细菌裂解充分即可,即菌液清亮不粘稠
8、测序确认
测序引物:pGEX-3通用引物
测序样品:过夜菌1ml;质粒(浓度大于50ng/μl,10μl)
9、中提质粒(Promega)
10、表达纯化GST融合蛋白
(1)已经转化的菌液,或者重新转化BL21(DE3)pLysS
(2)活化:取20μl菌液加入11ml LB(Ampr)(500倍稀释),37°C,250rpm,过夜(16 h)
(3)取10ml菌液加入100ml LB(Ampr)(10倍稀释)(剩余菌液4°C保存)
(4)37°C,250 rpm,1 h 10 min-1 h 20 min,OD600 0.6-0.8(OD600小于1.0即可)
(5)取1ml菌液作为诱导前对照,冰上放置
(6)加入IPTG,终浓度1 mM
(7)30°C,250rpm,诱导适当时间(预实验确定)
(8)取1ml菌液作为诱导后对照,连同诱导前菌液,12000rpm,离心2min,收集菌体,加入100μl 1×SDS上样缓冲液
(9)其余菌液,分为两份,倒入50ml离心管,5000rpm,离心20 min,收集细胞
(10)每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体,转移小烧杯中(无气泡)
(11)超声破碎细胞:超声3s,间隔10s,40次左右,超声强度200-300W(冰浴)
(12)将超声后菌液转移到50ml离心管中,4°C,13000rpm,离心20-30min
(13)将上清转移到1个50ml离心管中,取出50μl,加入50μl 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存)
(14)将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液(或PBS)重悬,取出50μl,加入50μl 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C保存)
(15)将四个样品煮沸3min,12000rpm,离心5min
(16)8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适,30μl上样,顺序:诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀
(17)考马斯亮蓝染色
(18)混匀glutathione sepharose beads(4B)(mixed slurry),取200μl加入15ml离心管中(2份)
(19)加入10ml PBS,混匀,3000rpm,离心3min,弃上清
(20)加入超声后上清液,4°C轻柔摇荡60分钟(或过夜)(横放)
(21)4°C,3000rpm,离心3min
(22)10ml GST裂解缓冲液洗涤2次(冰上)
(23)10ml TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)洗涤2次(冰上)
(24)弃上清,加入1倍柱床体积的TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油),混匀
(25)取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE
(26)-20°C保存beads
11、GST-Pull-down
(1)10cm培养皿中,未处理的细胞或者转染的细胞(3-5μg质粒转染10cm培养皿,Cos-7、293T或者其他细胞,转染24h)
(2)加入1ml 细胞裂解缓冲液,细胞铲刮下细胞(冰上)
(3)将裂解液收集到1.5ml离心管中,振荡30s,冰上放置5min,重复2-3次,充分裂解细胞
(4)4°C,12000rpm,离心15min,收集上清
(5)测定蛋白浓度,取1mg总蛋白做GST-Pull-down?
(6)留30μl作为input对照(input与Pull-down蛋白量约为1/10)
(7)其余溶液,加入20μl glutathione sepharose beads(PBS洗涤过),4°C,轻柔振荡20min
(8)12000rpm,离心3min
(9)收集上清,分为两份,一份加入1-15μg GST结合的beads,另一份加入等量 GST-融合蛋白结合的beads,4°C,轻柔振荡60min
(10)3000rpm,离心3min,回收上清
(11)1ml 细胞裂解缓冲液洗涤3次
(12)弃尽上清,加入25μl 2×SDS上样缓冲液
(13)煮沸3min,12000rpm,离心3min
(14)SDS-PAGE,上样顺序:细胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白(x:LSB)
(15)考马斯亮蓝染色或免疫印迹
[附录]
GST裂解缓冲液(前四个组分配好之后4°C保存,DTT和蛋白酶抑制剂现用现加)
配方一
500ml贮存液 | 10ml工作液 | |
150mM NaCl | 15 ml 5M NaCl | 10ml贮存液 |
20mM HEPES pH7.5 | 20ml 0.5M Hepes pH7.5 | |
5mM MgCl2 | 10ml 1M MgCl2 | |
1% TritonX-100 | 5ml 100% Triton-X 100 | |
1mM DTT | 10μl 1M DTT | |
1mM PMSF | 34μl 0.3M PMSF | |
inhibitor cocktail | 10μl inhibitor cocktail |
配方二
500ml贮存液 | 10ml工作液 | |
200mM NaCl | 10ml贮存液 | |
25mM HEPES pH7.5 | ||
2mM DTT | 20μl 1M DTT | |
1mM PMSF | 10μl 1M PMSF | |
inhibitor cocktail | 10μl inhibitor cocktail |
TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)
500ml 贮存液 | ||
150mM NaCl | 15ml 5M NaCl | |
20mM Tris pH7.6 | 10ml 1M Tris pH7.6 | |
5mM MgCl2 | 0.5M MgCl2 | |
1mM DTT | 1M DTT |
常用IP细胞裂解液
500ml贮存液 | 10ml 工作液 | |
50mM Tris-HCl, pH7.5 | 25ml 1M Tris-HCl, pH7.5 | |
150mM NaCl | 15ml 5M NaCl | |
2mM EDTA | 2ml 0.5M EDTA | |
0.5% NP40 | 25ml 10% NP40 | |
0.5% Triton X-100 | 25ml 10% Triton X-100 | |
0.5mM DTT | 2.5ml 1M DTT | |
1mM PMSF | 100μl 100mM PMSF | |
1mM NaF | 1ml 0.5M NaF | 20μl 0.5M NaF |
complete protease inhibitors |
cleared lysates were incubated for 1.5 h with 3 μg immobilized GST or GST-32