植物体内可溶性蛋白和非可溶性蛋白含量的测定实验
实验方法原理
植物材料经Tris-HCl缓冲液研磨、离心后,可溶性蛋白质溶于上清液中,非可溶性蛋 白则存在于沉淀部分。将沉淀用碱水解,则会得到非可溶性蛋白的提取液。蛋白质提取 液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。在一定范围内,蛋白质的含量与反应液在595nm波 长的吸光度呈正比,由此可求出蛋白质的含量。 | |
实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 牛血清蛋白标准曲线的制作 (1)取6支试管,编号,按下表配制每管含量为0~100μg的牛血清蛋白标准液。 加入表中试剂后,摇匀,以0号管为空白对照,在595nm波长处测定其吸光度(A)值。 (2)标准曲线绘制 以牛血清蛋白含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。 2. 蛋白质的提取 称取叶片0.3~0.5g,剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3 ml,加少量石英砂,在 冰浴中快速研磨成匀浆,匀浆倒入离心管中,再用5 ml提取液(分两次)将研钵 中匀浆洗入离心管,然后在10000 r/ min,4℃条件下离心20min,上清液即为 可溶性蛋白质提取液。 将离心所得的沉淀加3 ml 1mol·L-1NaOH溶液,在90℃恒温水浴中加热20min后, 在4000 r / min,4℃条件下离心10min,上清液即为非可溶性蛋白质提取液。 3. 测定 上述两种上清液各取0.1 ml分别放入2支试管中,每管再加Tris缓冲液0.9 ml, 空白对照管加Tris缓冲液1 ml,然后各管分别再加入考马斯亮蓝染色液5 ml, 摇匀,在595nm波长处测定吸光度(A)值。 五、结果计算 根据所测得的样品液吸光度值,从标准曲线查出蛋白质含量,按下公式计算可 溶性蛋白质和非可溶性蛋白质含量。 |
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