质粒DNA的超速离心分离（二）
用以上公式算出的离心时间和实际离心结果非常接近。从公式可以看出T反比子（N4、r2），显然在CsCl不结晶析出的前提下提高（N4、r2）将会减少离心时间,而增加转速的效果特别明显。但是对于某些较低转速转头（如 65,000rpm以下）CsCl自形成梯度所需时间过长（10小时）以上，因此质粒DNA纯样品区带形成的时间也比较长.
作为对全管初始等密度条件的改进，近几年发展了阶梯形不连续CsCl梯度的平衡等密度离心，即离心管初始梯度分二部分：
下部：高密度区（ρ=1.80-1.81g/cm3），占总容量1/3。
上部：低密度区（ρ=1.46-1.48g/cm3），占总容量2/3，实验证明，二阶不连续CsCl梯度可比全管等密度离心所需时间要短得多（以12ml垂直管转头为例，质粒DNA，CsCl梯度55,000rpm，20℃；不连续二阶梯度离心为5.5 小时,全管等密度离心为8小时）。
二阶不连续梯度离心，样品加在靠离心管底部的高密度区，无论对何种转头，其r很大；而且只存在样品的上浮而不存在低密度区（低离心加速度区）样品的沉降；在接近DNA浮动
密度区初始密度差较大,自形成梯度，时间较短；由于以上原因缩短了离心时间。（4）超高速多级（转速）分离：很明显，根据T公式提高转速将会加速CsCl梯度的形成，离心时间也会相应缩短。但是，在某温度下的高转速，长时间离心分离对于较高密度的CsCl来说很可能产生局部结晶析出，而局部结品析出不仅会影响梯度，而且会因析出的固态CsCl因损伤离心管壁而造成离心失败或事故.为此,对于质粒DNA离心分离实验，由于新型超速机的可编程序运转的特点。可以从极高转速逐渐向稍低转速推移，每次实验分成很多转速挡，既提高了效率，又保证了实验成功和安全。
当然，这类实验是要经过多次摸索，才能形成常用的离心程序，美国Beckman公司和日本Hitachi koki株式会社都在各自的先进的超速机上做了大量实验，并向用户推荐可靠、高效的离心理序[2、3]。
三、典型的质粒DXA超速离心分离举例
1.传统分离举例：
例（1）单管容量为12ml，最高转速在50,000rpm以下的角式转头，12PA密封管，各厂新型超速机。
样品+TE液（配成pH8.0），EB加入量0.2mg/ml，加入CsCl配成全管ρ=1.57g/ml45,000rpm×36小时，20℃，慢减速或55,000rprn×16小时+40,000rpm×1小时，20度慢减速。
分离结果:管中部稍下形成纯质粒DNA带，中部稍上出现DNA片断带，近底部为RNA沉淀，上浮物为蛋白质。
特点：分离结果较好，但纯样品带较宽，分离时间很长，用去近1亿转驱动部寿命。
例（2）单管容量为5ml，最高转速为65,000rpm的铁吊椅甩平转头，5PA管，样品配置同例（1）
特点：同例（5） （用去0.2亿转驱动部寿命）。
36,000rpm×55小时,20℃,或32,000rpm×70小时,20℃。
·分离结果及特点：分离结果很理想，质粒DNA带很窄，RNA沉降于离心管球底。但离心时间过长，成本较高（用去1.1亿~1.3亿转驱动部寿命）。
2.垂直管转头离心分离：
例（3）日本日立cp100α主机，P100VT转头（700,000×g,8×5ml），5PA密封管，样品及梯度配置同例(1)
100,000rpm×1小时50分,20℃,慢减速(7档)。
·特点:离心结果与例(1)相似,由于转速极高，壁部RNA沉淀很紧，在降速过程中对DNA污染很少。离心时间很短，高效，低成本(用去0.12亿转驱动部寿命)。
例(4)最高转速为50,000rpm的钛垂直管转头，容量8×40ml，40PA密封管，样品配置如例（1） 50,000rpm×24小时，20℃，慢减速。
特点：大容量分离，RNA沉淀对DNA带稍有污染。
3.近垂直管转头分离
例（5）Beckman1NVT90转头XL-90主机，8×5ml，5PA密封管，转头最高转速90,000rpm，646,000×g。
样品+TE液（配成pH8.0），E·B加入量为0.2mg/ml，Triton X-100加入量为0.01%，加入Cscl配成p=1.55g/ml。78,000rpm×4小时，20℃，慢减速。
特点：由于Triton X-100的作用，RNA沉淀加速滑向离心管底，转头减速过程中对DNA没有污染，分离结果很理想（用去0.2亿转驱动部寿命）。
例（6）日本日立CS120EX或美Beckman
TLX微量超速机，最高转速为120,000rpm的NVT（NT）转头，8×2ml，2PA密封管，样品及梯度液配置基本同例（5），但CsCL配成p=1.55g/ml,120,000rpm×3小时，20℃，慢减速。
特点：同例（5）（用去0.2亿转驱动部寿命）
4.不连续阶梯梯度分离：
例（7）日本日立SRP83VT转头，80,000rprm，549,000g，8×5时，5PA密封管（日立CPα，β系列机或SC夏系列机），梯度液配置：
先配置TE液+Cscl，ρ=1.47g/ml共3.5ml，先注入5PA密封管。
再配置TE液+样品+CsCl配成ρ=1.81g/ml， E.B.0.2mg/ml，共1.5ml用注射器伸入管底缓缓注入使原先的p=1.47液上浮。
83,000rpm×1小时，20℃，慢加速，慢减速，结果同例(3)。
特点：由于使用了二阶不连续梯度,CsCl自形成梯度时间缩短。超高转速，RNA沉淀很紧，对DNA带污染很小，高效，低成本（只用去0.05亿转驱动部寿命）。缺点是样品加入量稍小。
例（8）日本日立RP55VF：转头，55,000rpm，293,000×g，12×5ml，样品及梯度液配置同例（7） 55,000rpm×4.5小时，20度，慢加、减速。结果与例（7）相似。
5.超高速多级（转速）分离：
例（9）：BeckmanXL-90超速机，NVT-90转头90,000rpm，645,000×g，8×5ml，5.1PA密封管，样品及梯度液配置同例（5）。
多级分离：90,000rpm×l.5小时+87,000rpm×0.25小时+83,000rpm×0.25小时+81,000rpm×0.50小时+80,000rpm×0.50小时，20℃，慢减速。
（以上实验亦可在日本日立CP100α或90α主机上做用P100VT转头，结果相同）。
特点：结果同例(5)，但时间降为3小时（0.16亿转）
例（10）Hitachi微量超速CS-120EX或CS-100EX微量超速机，S100AT5角式转头，100,000rpm，550,000×g，8×5ml，样品及梯度液配置与例(3)基本同，但样品+TE液配成ρ= 1.55g/ml
100,000rpm×4.5小时+98,000rpm×15分+96.000rpm×30分+94,000rpm×30分+90,000rpm×25分+85.000rpm×30分
（共7小时），20℃，慢减速。
特点：使用角式转头，微量超速机，在离心力较小的条件下（与大型超速机相比），离心时间较短，RNA沉向管底，分离结果很理想。
四、质粒DNA超速离心分离注意事项
1.防止污染
防止脱氢酶污染：脱氢酶能使DNA降解或变性，而它又无处不在（皮肤上，没清洗并没消毒的器具表面……），所以，在质粒DNA分离实验的每一个环节都要注意这一点．有效的办法是器具（离心管、盖、注射器、移液器、盛器等等）的消毒（蒸气消毒或0.1%焦碳酸二乙酯消毒）。虽然，我们可以加DFP（二异丙基确酸氟）或PMSF（苯甲基磷酸氟）来抑制脱氢酶的降解使用,但主要手段还是清洗和消毒。
为防止皮肤上核糖体污染，操作时应戴上手术用手套。
2.防止重金属盐中存在的重金属离子和DNA结合成复合物：CsCl为电离介质，在离心前CsCl应过柱以消除Cs离子，对接触样品的器皿也要清洗，并用去离子水冲洗。
3.样品的加载量 样品加入量与样品浓度有关，为了提高分辨率，样品加入量应加以控制，合适的加入量应以前人实验作参考。自行试验时，每毫升梯度液样品量约为10μg~20μg。
4.对于角式、垂直、近垂直转头的自形成梯度平衡等密度分离，可用0~100Orpm快加速及1,000rprn~0慢减速，阶梯梯度则要求慢加速，慢减速，近代起这机都提供了很好的范例，供用户选择加、减速速率时参考。
5.转头在离心开始时温度应和离心运转时工作温度基本一致（土5℃），转头预冷温度过低（10℃以下）在极高转速，短时间离心时，可能因来不及升温而出现CsCl析出，使实验失败或发生事故。
6.合适的取样方法：质粒DNA超速离心分离加样较简易，离心后取样方法和操作水平将决定回收率和样品纯度。首先，取样环境应和离心工作温度相近（士5℃）；取样时实验台上应无振动源；根据实验室条件相应选择横向穿刺、底部空孔、离心管切割或用梯度仪收集。但无论哪一种方法部必须小心行事。
7.合适的pH值，核酸类佯品在实验全过程中都应保持在pH8.0的TE液中，pH值过高过低也会使DNA变性。
8.离心管及加液量：由于近代质位DNA的超速离心分离使用了非常高的转速，对离心管材质要求也很高，一般做这类实验的离心管只用一次。最好是用密封管，而且一段以选择PA管为好。离心管存放期不超过2~3年，使用密封管或有盖薄壁管样品要加满。使用甩平转头液面距管口2~3毫米以防止弯月面溢液或管口翻卷。
