聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚...-1
一、目的：
1．学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
2．掌握聚丙烯酰胺园盘电泳的操作技术。
3．比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。
二、原理：
（一）盘状电泳原理
盘状电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2厘米），然后再进行电泳分离。
盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性（discontinuity），凑巧分离出的区带也很象圆盘状（discoid
shape），取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。因此，英文名称为disc electrophoresis，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：（见图15-1）。上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。上下槽的缓冲液中分别有正、负电极通入。上槽底部有很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。
这里仅以Davis和Orstein（1964）用分析血清蛋白的高pH的不连续系统为便
说明其基本原理。此系统是一个高pH的碱性系统，或称阴离子系统，最初用于分析血清蛋白，但也适用于其他的酸性和中性蛋白。很多细胞蛋白质，或病毒的结构蛋白在此系统中（pH8—9）解离成阴离子，向阳极移动。系统由下列三种不连续的凝胶组成。即在每支玻璃管中装有三层不同的凝胶（见图15-2）。最上层为样品胶，中层为浓缩胶（又称间隔胶或积层胶），下层为分离胶（又称电泳胶）。
在盘状电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应,使样品分离效果好，分辨率高。例如人血清用纸电泳(PH8.6)可以分成5—7个成分，而用盘状电泳也可分成20—30个条带清晰的成分（参看图15-3）。若采用不连续的浓度梯度凝胶柱，则可增至62个条带。又如人的唾液经盘状电泳。可分出10多个蛋白质条带（参看图15-4）。
下面就盘状电泳过程中三种物理效应的原理加以说明。
1．样品的浓缩效应：由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。
（1）凝胶层的不连续性：三层不同的凝胶，其作用如下：
样品胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，样品预先加在其中再聚合起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中。
浓缩胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，有防对流作用。样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。
分离胶：为小孔胶，一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离。也有防对流作用。
蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。由于凝胶层的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。
（2）缓冲液离子成分的不连续性
在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方面泳动，其迁移率不同，两种离子若能形成界面，则走在前面的离子称为快离子（又称先行离子），走在后面的离子称为慢离子（又称随后离子）。为使样品达到浓缩的目的，需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小不相同的两种离子。并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相。即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。
为了保持溶液的电中性及一定的pH，需加入一种与快、慢离子符号相反的离子，称为缓冲配对离子。使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中（即三层凝胶及电极缓冲液中）。例如分离蛋白质样品时，通常用Cl-为快离子，NH2CH2COO-为慢离子，采用三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）作为缓冲配对离子。
电泳开始前，如图15-5A所示，慢离子位于两个电极槽中，快离子分布在三层凝胶中，样品在样品凝胶中，缓冲配对离子位于全部系统中。电泳进行中如图
15-5B所示，快离子与慢离子的界面向下移动，由于选择适当的pH缓冲液，使蛋白质样品的有效迁移率（有效迁移率=mα，m为迁移率，α为解离度）介于快离子与慢离子的界面处，而浓缩成为极窄的区带。它们的有效迁移率按下列次序排列：mclαcl＞mpαp＞mGαG（Cl
代表氯离子，P代表蛋白质，G代表甘氨酸负离子）。样品若是有颜色的，可以看到样品在界面处浓缩成极窄的区带。样品的分离，如图15-5C所示。当样品达到浓缩胶与分离胶界面处，离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，然后分成多个区带
（3）电位梯度的不连续性
电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关，因为电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积。迁移率低的离子，在高电位梯度中可以与具有高迁移率而处于低电位梯度的离子具有相似的速度。
在不连续系统中，电位梯度差异是自动形成的。电泳开始后，由于快离子的迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。
电导与电位梯度是成反比的：
式中E为电位梯度，I为电流强度，η为电导率。
所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
当快离子、慢离子和蛋白质迁移率和电位梯度的乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。也就是说在高电位梯度区和低电位梯度区之间的地方形成一个迅速移动的界面（图15-6）。由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层.
4）pH的不连续性
在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。要求在样品胶和浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在快、慢离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。
①浓缩胶应有的pH值
② 分离胶应有的pH值
在分离胶中要求甘氨酸有效迁移率（mGαG）超过所有的蛋白质的有效迁移率。这样甘氨酸的泳动速度即超过所有蛋白质，使分离胶保持均一的pH及电位梯度，以便蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离（如图15-5C所示）。
血清中的前清蛋白在7.5%凝胶中的迁移率小于―0.5单位，则mGαG至少应为―5.0。即α=
1/3，按上述计算pH应为9.5。实际上Davis所用的配方中，分离胶的pH值为8.9。但在电泳分离时，根据实际测定证明与理论计算相符，实际上比原制备时的pH约高出半个pH单位，所以与要求的数值是符合的。
2．分子筛效应
分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛作用，则是大分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。
3．电荷效应
蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状。在进入分离胶中时，此种电荷效应仍起作用。
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