聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚...-2
（二）聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理
1．性能
聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2．制备原理
聚丙烯酰胺是用丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N,N＇,N＇-methylene bisacrylamide，简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成。它们的结构式见下页。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：
（1）化学聚合：化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（ammonium
persulfate，简称AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N＇,N＇-四甲基乙二胺（N,N,N＇,N＇-tetramethyl
ethylenediamine，简称TEMED），其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile，简称
DMPN）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。叔胺要处于自由碱基状态下才有效。所以在低pH时，常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，一些金属离子也能抑制聚合。冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
（2）光聚合：光聚合通常用核黄素为催化剂。不一定加TEMED即能聚合，但加入则可加速聚合。
光聚合通常需要有痕量氧存在，核黄素经光解形成无色基。后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量的氧会阻止链长的增加，应该避免过量的氧存在。
光聚合通常用日光灯或普通钨丝灯泡作光源，直接日光或室内强散射光也可以。
用核黄素进行光聚合的优点是：①核黄素的用量很低（1毫克/100毫升）；②通过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔凝胶较适合。化学聚合的凝胶孔径较大，因而采用过硫酸铵-TEMED催化系统制备小孔凝胶（分离胶），而且制备的重复性好。
3．凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶浓度与被分离物的分子量大小的关系，大致范围如表15-1。
聚丙烯酸胺：
常用的所谓标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5%的标准凝胶或用4—10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。
凝胶的机械性能、弹性是否适中是很重要的，胶太软易于断裂，尤其在制作板型电泳的薄片状凝胶时，太软很难操作。太硬则脆，也易折断。凝胶的透明度、粘着度是否合适也影响分离效果。凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度取决于凝胶总浓度和 Acr与Bis两者之比例。
凝胶密度或凝胶浓度，可以用二个字母T和C来定义。T代表丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺二个单体的总百分浓度。C代表总浓度T中交联剂Bis的百分浓度。Hjertern，S.推导出如下这个式子，用以计算凝胶的用量。
这里 为丙烯酰胺的量（g）
b为亚甲基双丙烯酰胺的量(g)
m为缓冲液体积（ml）
/b的值是有临界线的，如果 /b＜10，制成的凝胶脆而易碎，坚硬而不透明。如果 /b＞100，即使5%的丙烯酰胺也是糊状的，容易破碎。 /b的值接近30 时，（其中丙烯酰胺的量必须＞3%），可以制成既有弹性又完全透明的凝胶。
Davis,B.J.在1964年，研究了丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的浓度范围，分别为1.5—60%和0—0.626%之间的凝胶形成情况。他发现丙烯酰胺浓度＜2%，亚甲基双丙烯酰胺浓度＜0.5%，不发生聚合凝固作用。为了获得一种有弹性的凝胶，在增加丙烯酰胺浓度的同时，应适当减低亚甲基双丙烯酰胺的浓度。对于这个要求，Richards,E.C.等人提出了如下一个经验公式：
C=6.5―0.3T
浓度在5—20%范围内，可以应用这个式子容易地计算凝胶的组成用量。式中C可有1%的变化。
对于人血清蛋白质的分离，Brackenridge,C.J.等人，推导出了下面这个经验式，用以计算最适的凝胶浓度，以便获得最好的分辨率。
B=0.201―0.0112T
这里，B 代表亚甲基双丙烯酰胺的百分浓度，T为二个单体总的百分浓度。
用于研究大分子核酸的凝胶多为大孔径凝胶，太软，不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。有的在3%凝胶中加20%蔗糖，也可增加机械强度而又不影响孔径大小。
（三）几种染料的性能及染色原理
1．氨基黑 10B（amino black 10B）
C22H13O12N6S3Na3
MW=715，λmax=620―630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染SDS-蛋白质时效果不好。另外，氨基黑染不同蛋白质时的着色度不等，色调不一（有蓝、黑、棕等），作同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质-染料量（吸收值）的标准曲线。
2．考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R250）。C45H44O7H3S2Na，MW=824，
λmax=560―590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
3．考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant
cyaninG。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。MW=854；λmax=590―610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析
4．1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalene sulfonic
acid，简称ANS），本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后，取出凝胶入在平皿中，用此染料溶液浸1—3分钟，用长波紫外灯照射时，产生黄色荧光。可显示蛋白质100微克，如果不明显，可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在3mol·L-1盐酸中几秒至2分钟，使表面蛋白质稍变性，然后再用ANS染色，这样可显示蛋白质20微克。
这样的染色优点是可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。可将该区带切下来进行酶活力测定；也可直接把凝胶捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不影响抗体的产生。
聚丙烯酰胺盘状电泳具有使样品区带浓缩变窄的作用，所以分辨力高，在很多情况下超过超速离心和常用的层析及一般电泳技术；设备简单，样品量小（1—100微克）；时间短，操作方便，可分离物质的分子大小范围广泛，由多肽到核糖核蛋白体及病毒都可以分离，亦可改变为超微量测定（10-9—10-12克），并可结合SDS来测定蛋白质亚基分子量；或测定核酸等的分子量。这种方法现在几乎代替了超速离心沉降法。它还可以结合等电点聚焦电泳以提高分辨率。
聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳用途较广，对生物高分子化合物能进行分离、定性、定量分析，又能用于制备毫克水平的材料。
三、器材及试剂：
1．器材：
①血清以及其他蛋白质样品。
②圆盘电泳槽、稳压直流电源（500V）。
③玻璃管0.5×7―10cm（×1）及制胶架。
④日光灯。
⑤三角烧瓶。
⑥注射器10ml（×1）、长针头。
⑦滴管。
⑧培养皿￠10cm（×5）。
⑨吸管1ml（×1）、2ml（×1）、5ml（×1）、0.5ml（×1）。
⑩凝胶成像系统或光密度计。
2．试剂：
①丙烯酰胺（Acr）：分析纯。如不纯，可按下法重结晶：90g丙烯酰胺，溶于500ml50℃氯仿，热滤，滤液用盐冰浴降温，即有结晶析出。砂芯漏斗过滤，收集结晶。按同法再重结晶一次。结晶于室温中赶尽氯仿（约得50g左右，M.P84.3℃），贮棕色瓶中，干燥低温保存（4℃）。
②N，N＇- 亚甲基双丙烯酰胺（Bis）：分析纯。如不纯按下法处理：12g亚甲基双丙烯酰胺，溶于1000ml40—50℃丙酮。热滤，滤液慢慢冷至-20℃，结晶析出，砂芯漏斗吸滤，结晶用冷丙酮洗数次，真空干燥。贮棕色瓶，干燥低温（4℃）保存。
（注意：Acr和Bis都是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，应在通风橱内操作。操作者需戴医用乳胶手套）
③N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺（简称TEMED）：密封保存。可用N-二甲基氨基丙腈或三乙醇胺代替，但效果较差。
④三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）。
⑤核黄素：避光保存。光聚合催化剂。
⑥7%醋酸溶液（V/V）。
⑦0.5%氨基黑10B（C22H13O12N6S3Na3）溶液：用7%醋酸溶液配制。
⑧0.01%溴酚蓝溶液。
⑨蔗糖。
⑩PH8.4硼酸缓冲液（0.2mol·L-1硼酸盐）。
四、操作步骤：
1．贮备液的配制：按表15-2配制A、B、C、D、E、F各贮备液：
表15-2 贮备液配制
