聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）分离血清蛋白质（三）
3）电位梯度的不连续性
电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关，因为电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积。迁移率低的离子，在高电位梯度中可以与具有高迁移率而处于低电位梯度的离子具有相似的速度。在不连续系统中，电位梯度差异是自动形成的。电泳开始后，由于快离子的迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。
电导与电位梯度是成反比的：
式中E为电位梯度，I为电流强度，η为电导率。
所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
当快离子、慢离子和蛋白质迁移率和电位梯度的乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同。
在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。也就是说在高电位梯度区和低电位梯度区之间的地方形成一个迅速移动的界面（图15-6）。由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。
4）pH的不连续性
在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。要求在样品胶和浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在快、慢离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。
①浓缩胶应有的pH值
②分离胶应有的pH值
在分离胶中要求甘氨酸有效迁移率（mGαG）超过所有的蛋白质的有效迁移率。这样甘氨酸的泳动速度即超过所有蛋白质，使分离胶保持均一的pH及电位梯度，以便蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离（如图15-5C所示）。
血清中的前清蛋白在7.5%凝胶中的迁移率小于-0.5单位，则mGαG至少应为-5.0。即α= 1/3，按上述计算pH应为9.5。实际上Davis所用的配方中，分离胶的pH值为8.9。但在电泳分离时，根据实际测定证明与理论计算相符，实际上比原制备时的pH约高出半个pH单位，所以与要求的数值是符合的。
2．分子筛效应
分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛作用，则是大分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。
3．电荷效应
蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状。在进入分离胶中时，此种电荷效应仍起作用。
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