聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚...-3
上述各贮备液都需冷藏（4℃）。尤其是C、D两贮液，由于Acr及Bis易水解生成丙烯酸和NH3，冷藏也只能保存1—2月。如 PH超过5.2，即失效。
2．凝胶的制备：
（1）将内径0.5cm的玻管切成7—10cm长，切口磨光，洗液浸泡后，水洗净烘干。
（2）分离胶的制备及预电泳：于一小三角烧瓶内，按A∶C∶H2O∶E=1∶2∶4.6∶0.4（V/V）加入各贮液，摇匀，抽气（水泵或油泵）10分钟，将此胶液装入玻管2/3高度（玻管直立，下端插入制胶架凹横内凹槽内事先加入F液1—2滴）。表面覆盖少量蒸馏水，以隔绝空气并使胶面平整。用日光灯照射20分钟，刚加水覆盖时，可看出界面，后界面逐渐消失，聚合完成后，界面又重新出现，再静置30分钟使聚合完成。胶液凝聚后，用小滤纸条，小心吸去表面水分。
分离胶的预电泳（此步操作根据实验的需要决定取舍）：凝胶聚合程度一般在90%以上。残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品（如酶）会造成钝化或引起其它人为效应。因此有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，这步称为“预电泳”。若直接用光密度计来扫描分离的区带，则预电泳步骤更为必要，因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收，会干扰测定。
预电泳步骤：小心地拔出玻璃管，用滤纸吸干（不要直接接触胶面）后，用分离胶缓冲液（即不含TEMED的A液）洗涤一下。把玻璃管插入电泳装置中，塞紧橡皮塞上下电极槽中加入分离胶缓冲液，玻璃管下端不得有气泡，预电泳用3毫安/管，30分钟—2小时。
预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。如不用预电泳也可采用加1—5%巯基乙醇或二巯基苏糖醇到缓冲液和样品中来抵消过硫酸铵的氧化作用。
预电泳后，凝胶管含少量缓冲液，并用液体石腊封住，在4℃可贮藏几天。取用时，用注射器吸去液体石腊。
（3）浓缩胶（又称成层胶）的制备：于一小三角烧瓶内按B∶D∶E∶H2O=1∶2∶0.5∶4.5（V/V）比例加入各贮液，混合后，抽气，加到玻管中分离胶的上面，高度约1cm，表面覆盖一层水，然后距日光灯10cm处进行光照，正常情况下，照射几分钟后，则凝胶液由淡黄色变成乳白色，表明聚合开始，继续照射30分钟，使聚合完全。凝聚后吸去表面水分。浓缩胶层应临用前制备。
3．样品的准备
聚丙烯酰胺盘状电泳可用以分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清（参看图15-3）、唾液（参看图15-4）、细胞膜蛋白、动植物及微生物的各种蛋白提取液、昆虫的体液、各种酶制品及核糖核酸等。初学者可采用血清样品练习操作。
盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管按体积需要5—100 微升的样品（约0.1—2毫米高）；按含量需要5—100微克。实际上就是用1毫克/毫升浓度的样品5—100微升。由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有少数组分的样品，可用到10—20微克；对于含有多种组分的样品，可用到200微克。即每一凝胶柱的样品容纳量不仅指所加的样品总量，更重要的是指样品混合物中各组分的量。所加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于±5%。
近来，样品胶一般已改用样品液中加入5—20%蔗糖或10%甘油代替，因为这样品胶的作用主要是抗对流，蔗糖液和甘油能起同样的效果。
如果样品离子强度太高，会引起分离界面模糊不清，严重时完全不能进行电泳。因离子强度太高时降低了蛋白质的电动电位，同时电导过高，在样品部分几乎没有电位梯度，以至样品的泳动速度近于零，不能泳动。硫酸铵盐析的样品或柱层析高盐浓度的洗脱部分，必须透析除盐，务必使电导低于分离胶的电导，以便形成足够的电位梯度，使区带在分离之前进行浓缩变窄。
如果样品过稀，加样体积太大时，相应地加厚浓缩胶层。玻璃管也要加长。一般采用稀样品液与浓缩胶之比为1∶1.2。
一个生物样品（粗抽提物），常需要事先经过处理（高速离心、微孔滤膜过滤、柱分离等），去除沉淀，消除混浊。或只取可溶性部分进行电泳。不然常有许多物质留在凝胶与缓冲液的界面上，会阻塞凝胶，干扰分离。当样品装载量与样品溶解度不相应时，也会在浓缩胶面上或浓缩胶与分离胶界面上产生沉淀，并造成拖尾现象（随着电泳过程，沉淀逐渐溶解、逐渐进入）。
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