RiboPrinter® 在肉毒梭菌鉴定和分子分型中的应用（一）
RiboPrinter® 在肉毒梭菌鉴定和分子分型中的应用
梭状芽孢杆菌是一个多样化的革兰氏阳性菌属，专性厌氧，在环境中普遍存在。这个属大约包含了100多个种，基因组内总体的G+C含量范围在22-55%，反映出该属内的细菌在系统进化关系上的巨大差异。 该属内最主要的食源性致病菌为肉毒梭菌和产气荚膜梭菌，它们均可通过毒素介导，通过直接产生毒素（如食源性肉毒中毒），或在肠道内生成毒素（如婴儿肉毒中毒和产气荚膜梭菌腹泻），从而引发食源性细菌性疾病。
肉毒梭菌简介 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）属于厌氧性梭状芽孢杆菌，为革兰氏阳性的多形态大杆菌，芽孢位于菌体近端，使菌体呈匙形或网球拍状。根据抗原性的不同，肉毒梭菌可分为8个型，分别是A、B、Cα、Cβ、D、E、F和G型。 肉毒梭菌产生的外毒素称为肉毒神经毒素（BoNTs，botulinum neurotoxins），肉毒毒素在目前已知毒素中毒性最强，一个人的致死剂量大约为1 µg，比氰化钾毒力大10000倍，和炭疽一样，可作为生物武器。BoNTs可引发食物中毒，即肉毒中毒，能够引起人类中毒的主要型别为A、B和E型。肉毒中毒的临床表现不同于其他食物中毒，胃肠道症状很少见，主要为神经末梢麻痹，发病率不高，但死亡率居细菌性食物中毒之首。 肉毒梭菌是一种腐物寄生菌，在自然界分布广泛，食物中肉毒梭菌主要来源于环境，如尘埃、粪便等，尤其是带菌土壤。肉毒梭菌的抵抗力一般，在45℃以上都受到抑制，80℃经20min可被杀灭。但其芽孢的抵抗力极强，可耐煮沸长达1-6h之久，于180℃干热5-15min或于120℃高压蒸汽下10-20min才能灭活，在酒精中可存活2个月，10%的HCl需60min才能破坏芽孢。蛋白分解型的肉毒梭菌（A、B和F型）芽孢比非蛋白分解型的B、E和F型的芽孢对热具有更强的抵抗力。芽孢在厌氧环境的食品中可发芽繁殖产生肉毒毒素，人类因食入已产生毒素的食品而发生肉毒中毒。另外，因肉毒梭菌随蜂蜜等食物进入婴儿肠道内产毒引发的婴儿肉毒中毒也有存在。 肉毒梭菌的形态特征和分类学
肉毒梭菌为多形态的厌氧性的杆状菌，长约4-6?m，宽约0.6-1.2 ?m，两侧平行，两端钝圆，直杆状或稍弯曲，可形成芽孢，卵圆形，位于次级端或偶有位于中央，常见很多游离芽孢，多单在，偶见成双或短链，A型和B型菌的芽孢大于菌体，位于菌体近端，使菌体呈匙形或网球拍状，其他的型芽孢一般不超过菌体宽度。有时呈现长丝状或链状，有时能见到舟形、带把柄的柠檬形、蛇样线状和染色较深的球茎状，这些属于退化型，当菌体开始形成芽孢时，常常伴随着自溶现象。肉毒梭菌具有4-8根周生性鞭毛，运动迟缓，没有荚膜。
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，肉毒梭菌归属为原核生物界、厚壁菌门、厚壁菌纲、芽孢杆菌科的梭菌属（Clostridium）。
肉毒梭菌这个种是基于单一的表型特征，即产生BoNTs的这个特性来分类定义的。Collins等（1998）又将其分为4个组（Group I-IV），这些群呈现出非常多样化的基因型和表型特征（见表一），菌株之间的差异程度要远远超过枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株之间的差异程度。
这种情况有时更为复杂，导致分类学上的困难，因为有些菌株从发育关系上来说与肉毒梭菌非常相近，但是并不产生神经毒素，因而没有归入肉毒梭菌这个种，如生孢梭菌（Clostridium sporogenes），诺维氏梭菌（Clostridium novyi），和其他一些未命名的梭菌；而有些菌株能生产神经毒素，却因系统发育较远，并未归入肉毒梭菌，如巴氏梭菌（Clostridium baratii）以及酪酸梭菌（Clostridium butyricum）。更复杂的情况是，Collins等（1998）还发现BoNTs的毒力基因能在菌株间不稳定地平行转移，从而产生不产毒的变种，或是携带部分或未知的BoNTs基因。正因为肉毒梭菌的种内多样性，导致了对于该细菌的分类学研究仍存在争议，给各种肉毒梭菌的检测、分离和鉴定方法，甚至是16S测序法鉴定都带来了一定的难度。
表一：肉毒梭菌的基本特征
特征 | 组I | 组II | 组III | 组IV |
毒素类型 | A, B, F | B, E, F | C, D | G |
人类疾病病原 | 是 | 是 | 是 | 否 |
最低生长温度（℃） | 10 | 3.3 | 15 | 不确定 |
最适生长温度（℃） | 35-40 | 18-25 | 40 | 37 |
最低生长pH值 | 4.6 | 5.0 | 5.0 | 不确定 |
最低生长水活度Aw | 0.94 | 0.97 | 不确定 | 不确定 |
氯化钠抑制 | 10% | 5% | 2% | 不确定 |
芽孢D100℃值（分钟） | 25 | < 0.1 | 0.1-0.9 | 0.8-1.12 |
芽孢D121℃值（分钟） | 0.1-0.2 | < 0.001 | 不确定 | 不确定 |
蛋白分解活性 | 是 | 否 | 否 | 微弱 |
脂肪分解活性 | 是 | 是 | 是 | 否 |
糖分解活性 | 否 | 是 | 微弱 | 否 |
相近的非产毒梭菌属菌种 | C. sporogenes C. putrificum | C. beijerinkii | C. novyi C. haemolyticum | C. subterminale C. histolyticum C. linosium |
毒力基因位置 | 染色体 | 染色体 | 噬菌体 | 质粒 |
基因组G+C含量（mol%） | 26-29 | 27-29 | 26-28 | 28-30 |
肉毒梭菌的传统鉴定和分离方法
正如前述，肉毒梭菌这个种是基于单一的表型特征，即产生BoNTs的这个特性来分类定义的，所以传统的表型和基因型鉴定方法，如生化反应、细胞脂肪酸组分分析以及16S测序等并不能给出明确的鉴定结果，见Collins（1998），Brett（1998），Ghanem（1991）。比如，16S测序方法已被证实无法区分肉毒梭菌及其两个近亲：诺维氏梭菌（Clostridium novyi）和生孢梭菌（Clostridium sporogenes）。
肉毒梭菌培养分离的第一步是增菌培养基及培养条件的确定。培养基可优先选用预还原性（Pre-reduced）厌氧无菌的熟肉基质培养基（可含或不含葡萄糖成分）（cooked meat medium），碎肉葡萄糖淀粉培养基（chopped-meat glucose-starch medium），或胰蛋白胨葡萄糖酵母提取肉汤（tryptone-peptone glucose yeast extract broth）。胰蛋白酶可被添加到配方中以灭活细菌素和激发神经毒素。溶菌酶的加入有助于复活热损伤的孢子，尤其适合于非蛋白分解型肉毒梭菌的菌株。
由于不同组别的肉毒梭菌的最适生长条件并不统一（见表一），所以最优的培养温度的选择仍然是个问题。Solomon（2001）等推荐采用28℃用于II组肉毒梭菌的培养，而用35℃用于其他组别的培养，不过目前已经有质疑认为其不适用鱼类和贝壳类食品中肉毒梭菌的检测。Anon（1998）等推荐采用30℃用于所有组别的菌株的培养，但在这个条件下I组的菌株得不到最优的生长。
培养5天后，接种的肉汤需做小鼠生物实验（Mouse Bioassay）以检测BoNTs的产生情况。另需培养10天以检测受损芽孢或延迟产芽菌株的生长情况仍然是十分必要的。所有的培养物还需最终通过镜检检测，观察菌株的形态特征，以获得鉴定结论。
疑似阳性的肉汤样本，连同疑似原因食品和临床样本（尤其是粪便）还需选用上述培养基进行严格厌氧环境下的二次培养以进行确认。培养基需包含以下成分： 卵黄：以检测酯酶阳性的肉毒梭菌菌株，见Silas（1985） 选择性抗菌剂：环丝氨酸，磺胺甲基异恶唑，甲氧苄啶等，见Silas（1985），Dezfulian（1981），Mills（1985） 由于肉毒梭菌不同组别菌株存在较大差异（尤其是I组和II组），专家们一致建议采用含抑菌剂和不含有抑菌剂的选择性平板同时进行对照实验，以便分析和获得更为准确的结果。
典型的肉毒梭菌的菌落形态见图一： Typical colonial growth of C. botulinum, together with an atypical lipase negative culture: Classically, C. botulinum colonies are usually gray-white on blood containing agars with circular irregular edges, and a clear zone of β-hemolysis.
Clostridium botulinum growing on blood agar （Below Left） Clostridium botulinum growing on egg yolk agar showing the lipase reaction after 72 hours of incubation （Below Right）
主要的肉毒梭菌的生化特征见表二和表三： 表二：各型肉毒梭菌的生化特性
型别 | A | B | C | D | E | F |
葡萄糖发酵 | + | + | + | + | + | + |
麦芽糖发酵 | + | (±) | (±) | (±) | (±) | (±) |
乳糖发酵 | - | - | (-) | (-) | - | - |
蔗糖发酵 | (-) | (±) | - | - | - | (+) |
靛基质产生 | (±) | - | (-) | (-) | - | - |
明胶液化 | - | (+) | (±) | (±) | (±) | (+) |
牛奶消化 | (+) | (±) | - | - | - | (+) |
注：肉毒梭菌的生化形状并不规律，即使同型也常见到株间差异；+表示阳性，-表示阴性，(±)表示视菌株而定，(+)表示多为阳性反应，(-)表示多为阴性反应。
表三：各组肉毒梭菌的生化特性
组别 | I组 | II组 | III组 | IV组 | |||||||
芽孢位置 | S | T | S | T | S | T | S | T | |||
动力 | + | - | + | + | - | + | |||||
有氧环境 | - | - | - | - | |||||||
葡萄糖 | + | + | + | - | |||||||
乳糖 | - | - | - | - | |||||||
麦芽糖 | - | + | d | - | |||||||
甘露醇 | - | - | - | - | |||||||
卵磷脂酶 | - | - | - | + | - | ||||||
酯酶 | + | + | + | - | |||||||
