如何做好荧光定量PCR实验？（五）
5、反应体系配制：
ð A2010A0101试剂盒：（探针体系）
FQ-PCR MasterMix-UNG混合物(2X) 25ul（终浓度为1×）；
上游引物（终浓度为50~900nM），下游引物（终浓度为50~900nM）；
探针（终浓度为200nM）；
待检样品 5ul（终浓度为10~100ng）；
无菌去离子水 补足，使总体积达到 50ul 。
ð A2010A0106 试剂盒:
反应体系终浓度：
1-2U的hot start Taq酶、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2－0.4mM的dNTPs、1×PCR buffer（A2010A0106）；50－900nM 的上游引物、50－900nM 的下游引物、200nM的探针、通常取2-5ul的模板,反应总体积通常为20－50ul
ð 自配热启动荧光－UNG 体系：
1-2U的Taq酶、1×PCR buffer、2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0104）；0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)、0.2－0.4mM的d(A,C,G)TPs、0.3-0.6mMdUTP(A2010A0108)；50－900nM 的上游引物、50－900nM 的下游引物、200nM的探针、通常取2-5ul的模板、反应总体积通常为20－50ul
6、反应体系和条件的优化；
使用高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start），最大程度降低了需要优化的参数。您只需要优化退火温度，就可以得到更灵敏、更可靠的定量结果。对于特殊结构的荧光PCR，您可以优化引物浓度，来得到更特异或更灵敏的结果。
使用通用PCR Master Mix 试剂盒进行反应体系的配制，可以适合更多的反应体系，如mRNA的普通RT-PCR检测，适用于合成质粒的PCR，同时也适用于荧光PCR，范围更宽。
采用成套的hot start Taq酶，您需要对酶量、镁离子浓度、UNG浓度、dUTP浓度、引物浓度、退火温度等参数进行优化(参照3：影响PCR及荧光PCR 的其他因素)进行优化，优化的指标越多，实验的不确定性就越大。避免在操作中引入更大的不确定性和不可重复性。注意：同样可参照的QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）使用注意事项。
7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析；
目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Applied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。
不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。
基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。
8、疑难解答
问 题 | 可能原因 | 建议解决方法 |
定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量 | DNA模板质量不好，含有抑制剂 | 提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA |
PCR引物设计较差 | 避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 | |
探针设计较差 | 对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针 | |
PCR引物合成较差 | 用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。 | |
荧光探针无功能 | 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 | |
模板浓度太低 | 使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。 | |
镁离子浓度太低 | 从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。 | |
引物浓度太低 | 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1） | |
选择优质酶进行扩增 | 选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素 | |
退火温度太高 | 使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。 | |
反应物中有不明物干扰 | 在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。 | |
定量PCR阳性对照无扩增曲线（针对：已经优化好的体系） | 引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认： | 反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； 正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； 确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强）。 |
仪器是否正常工作 | ||
定量PCR阴性对照一直有扩增曲线 | 模板或PCR残余污染 | 隔离污染来源，更换试剂。 使用UNG/dUTP防污染系统。 在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。 |
体系有问题 | 酶浓度不对，Mg离子浓度不对 | |
定量PCR（染料法）出现非特异信号 | 引物二聚体多 | 检查引物设计和合成环节，必要时更改引物 |
更换热启动酶 | 热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度 | |
设定检测信号时的温度 | 在更高的温度下检测荧光信号（此时引物二聚体已经解链） | |
定量RT-PCR | 无cDNA合成 | |
cDNA合成温度太高 | 降低保温温度 | |
反转录cDNA产物被二级结构封闭 | 提高保温温度。重新设计引物 | |
RNA被损害或降解 | 必要的话更换RNA | |
RNAse污染 | 维持无菌条件；加入RNase抑制剂 | |
荧光探针无功能 | 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 | |
灵敏度低 | 初始模板RNA不充分 | 增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA |
RNA被损害和降解 | 必要的话更换RNA | |
RNAse污染 | 维持无菌条件；加入RNase抑制剂 | |
无效的cDNA | 通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂 | |
无效的PCR扩增 | 注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 | |
检测使用仪器 | 扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后 | |
PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误 | 采用荧光探针法 | 增加结果特异性和产物的忠实性 |
循环数太多 | 降低循环数。 | |
四种dNTP的浓度不同 | 制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。 |
