一、主要试剂的配制
1. 平衡缓冲液:50 mmol/L Tris(pH7.5),0.5 mol/L NaCl,10 mmol/L
CaCl2,0.01%Tween 20,5 mmol/L 邻二氮菲。
2. 洗涤缓冲液1:50 mol/L Tris(pH7.5),0.5 mmoL/L NaCl,10 mmol/L CaCl2,0.05%Tween 20,5 mmol/L邻二氮菲。
3. 洗涤缓冲液2:50 mmol/L Tris(pH7.5),10 mmoL/L CaCl2,0.01%Tween 20,5 mmol/L邻二氮菲。
4. 8%分离胶(含0.1%明胶):30%丙烯酰胺2.7 ml,ddH20 4.5 ml,1.5 mol/L Tris(pH 8.8)2.5 ml,10% SDS 100 μl,10% 过硫酸铵(APS) 100 μl,TEMED 6 μl。
5. 浓缩胶:ddH20 2.1 ml,30%丙烯酰胺0.5 ml,1 mol/L Tris-HCI(pH6.8)0.38 ml,10%SDS 30 μl,10%过硫酸铵30 μl,TEMED 3 μl。
6. 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3):0.125 mol/L Tris-HCl,1.25 mol/L甘氨酸,0.5%SDS。
7. 5×上样缓冲液:30% 1 mol/L Tris-HCl(pH6.8),25%甘油,0.05%溴酚蓝。
8. 洗脱液:2.5% TritonX-100(去离子水定容)。
9. 孵育液:50 mmoL/L Tris-HCl,10 mmol/L CaCl2,1% TritonX-100,
pH7.5,去离子水定容。
10. 染色液:0.25%考马斯亮蓝R-250,45%甲醇,10%乙酸。
11. 脱色液:30%甲醇,10%乙酸。
二、实验方法
1. 收集生长对数期的癌细胞培养液。
2. 将500μl培养液,45μl明胶琼脂糖颗粒(使用前混匀)和45μl平衡缓冲液混合均匀后加入微型旋转柱中,于旋转混合仪上平衡30min。
3. 用洗涤缓冲液1洗涤琼脂糖颗粒,每次100μl洗涤3次,7000r/min离心除去洗涤缓冲液1。
4. 用100μl洗涤缓冲液2洗涤琼脂糖颗粒1次,7000r/min离心除去洗涤缓冲液2。
5. 向微型旋转柱中加入40μl的2x上样缓冲液,7000r/min离心。将离心后的上样缓冲液重新加入微型旋转柱中,于12000r/min离心10s。
6. 采用8%分离胶在130V恒压下电泳2.5h。
7. 用洗脱液在摇床上洗涤蛋白胶2次,各30min,除去胶中的SDS。
8. 37℃孵育蛋白胶24h,使MMP分解明胶。
9. 摇床上染色1h及脱色至条带清晰。
10. 蛋白成像:用凝胶成像仪进行拍照。
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