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明胶酶谱法操作

2019.4.18

实验概要

酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。

主要试剂

分离胶

浓缩胶

5×Tris –甘氨酸电极缓冲液

4 ×上样缓冲液

洗脱液

漂洗液

孵育液

染色液

脱色液A、B、C

实验步骤

1. 取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

2. 次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。

3. 根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5×上样缓冲液混合，13ul样本 4ul上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）

4. 配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。

5. 电泳结束后，将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl₂，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟，然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次，每次20分钟，接着，将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl₂ , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。

6. 孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

注意事项

1. 制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

2. 明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3. 用大梳子。

4. 孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5. 孵育的37度不要在CO₂培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6. 明胶要4度保存，配好后1周内使用。

明胶酶谱

Everlab云端实验室

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