摧毁你的皮肤屏障—KLHL24基因突变研究（二）
第二步：验证底物
首先测定KRT14蛋白含量，结果表明2位患者皮肤样品中的KRT14含量明显低于年龄相当的非患病对照组(Fig. 4f,g)。同时，与KRT14形成异二聚体的Keratin 5 (KRT5)含量也较对照组低，但keratin 1 (KRT1)含量没有发生变化（不与KRT14或 KRT5形成二聚体）。
角蛋白免疫荧光及皮肤分化标志物表明，患者基底层细胞中角蛋白大量减少，但基底上层角蛋白及分化标志物丰度保持不变(Fig.5)
Figure 5. IF staining of pan-keratin, KRT1, keratin10 (KRT10) and loricrin on skin sections of Patient 5 and a normal control.
HaCaT细胞中过表达KLHL24，会小幅度降低KRT14蛋白水平，而KLHL24-∆N28的过表达会使KRT14含量急剧降低(“input”in Fig.4e)；半衰期检测结果表明，KLHL24和KLHL24-∆N28过表达会使KRT14稳定性降低。
RNAi表明KLHL24下调会提升KRT14蛋白存在水平，而对于KLHL24-∆N28， 当siRNA靶点位于编码区时可以提高KRT14含量，位于5'或3'UTR区域时则无明显变化。
进一步检测293T细胞中KRT14泛素化水平，观察到KLHL24 或KLHL24-∆N28瞬时表达后与CUL3 和RBX1结合可提高KRT14的泛素化水平。
综合以上基因分析及生化实验结果可知，KLHL24可作为E3泛素连接酶作用于底物KRT14，其功能获得性突变体KLHL24-∆N28会导致底物KRT14的过度降解使皮肤完整性受损。
OK，现在我们知道了，患者之所以发生皮损，原来是角蛋白KRT14非正常大量降解所致，而这背后真正的魔手，归结于KLHL24突变。
既然KLHL24这么重要，追本溯源，那么它会不会也参与角朊细胞的分化过程呢？
为了研究KLHL24在皮肤分化中的调节作用，作者使用钙开关诱导小鼠角朊细胞分化模型。研究发现：
Klhl24编码的mRNA在分化过程中大幅提高，在一定程度上与角质细胞的分化标志物Lor， Krt10相近.
Krt14蛋白含量随分化大幅降低，而其mRNA水平却出现小幅度上升，表明在此过程中出现了蛋白降解。
据以往研究报道，Klhl24的表达可能会有转录因子p73的参与，而p73随着角质细胞的分化也会出现表达上调。
通过FISH，发现在正常和病人来源的皮肤样本中，基底层角质细胞较基底上层角质细胞的KLHL24表达量更低，而KRT14的含量则与此相反(Fig. 6)。
Figure 6. KLHL24 mRNA FISH experiment in skin samples of Patient 5: KLHL24 mRNA FISH (Magenta), KRT14 IF (Green). Arrows: upper periphery of the basal layer. Dot plot: quantification of the FISH intensity of the keratinocytes’ cytoplasmic area with positive or negative KRT14 staining respectively.
综上，表明在角朊细胞分化过程中， KLHL24表达上调并扮演了清除KRT14的角色。
体外研究告一段落，也是时候上活体小鼠模型了。
利用CRISPR/Cas9技术构建杂合子(Klhl24c.3G/T)及纯合子(Klhl24-/-)基因编辑小鼠（Fig.7d）（此模型小鼠由百奥赛图供应， 可以荣登Nature期刊也是荣幸之至，荣幸之至啊）
形态学方面：
Klhl24c.3G/T小鼠与野生型同窝鼠仔相比，呈现出更明显的与年龄相关的脱发，减重及体型小症状（Fig.7e），但是Klhl24-/-却表型正常。杂合子(Klhl24c.3G/T)及纯合子(Klhl24-/-)小鼠均没有表现出皮肤脆性。
蛋白表达方面：
提取Klhl24c.3G/T ，Klhl24-/- mice及野生型小鼠皮肤和大脑组织进行免疫共沉淀，免疫印记实验。发现皮肤组织中并无任何条带，大脑组织中则在Klhl24c.3G/T中检测到Klhl24-∆N28条带（Fig.7f）。这些结果和Human Protein Atlas的研究发现相符，即Klhl24在大脑组织中的表达量高于皮肤组织。
Fig7. (d) Illustration of the CRISPR/Cas9-mediated knock-in and knockout strategies. (e) Photograph of a 20-weekold Klhl24c.3G/T male mouse (left) and its wild-type male littermate (right). (f) Cerebral tissue extracts from a Klhl24c.3G/T mouse, its wild-type littermate and a Klhl24-/- mouse were immunoprecipitated with an antibody to KLHL24 followed by immunoblotting.
同时，Klhl24c.3G/T小鼠皮肤样本中，Krt14含量较野生型降低(Fig. 7g–i)，降低程度显著但仍高于患者皮肤Krt14含量，此现象在一定程度上解释了Klhl24c.3G/T小鼠为何没有皮肤脆性表型。
Fig7. (g) Immunoblotting using skin extracts shows a reduction in Krt14 protein levels in Klhl24c.3G/T mice in comparison to a wild-type littermate. (h) Quantification of the relative intensity of the Krt14 bands for Klhl24c.3G/T mice (n = 5) and their wild-type littermates (n = 11) from five independent experiments.(i) Immunofluorescence of Krt14 in skin sections from a Klhl24c.3G/T mouse and its wild-type littermate.
划重点
KLHL24可以作为E3泛素连接酶对底物KRT14进行泛素化修饰，并发现其获得性功能突变体可以导致KRT14的大幅度降低并引发人类的皮肤脆性病症（Fig.8）
Figure 8. Schematic of the disease-causing mechanism of KLHL24 mutations. (a) Under normal condition, KLHL24 protein is tightly controlled by autoubiquitination and turnover of KRT14 by CUL3–RBX1–KLHL24 is at a low level. (b) In the EBS cases we found, KLHL24-∆N28 is stabilized through abolished autoubiquitination. Overstabilized mutant KLHL24 leads to excessive ubiquitination and degradation of KRT14.
角朊细胞分化时， KLHL24的诱导表达及其对KRT14的泛素化修饰可能参与其中，而KLHL24的自泛素化可以防止KRT14的过度下降，从而提供了一层安全保障。
在EB的疾病表型方面，人类和相应的小鼠模型会存在一定差异；在我们的研究中，KLHL24起始密码子突变会导致KRT14含量不同程度的降低，以及在人和小鼠中不同的皮肤疾病表型，至于为何会出现这种差异，还有待进一步研究。
结语
失去了N端28个氨基酸，就可以导致KLHL24性情大变疯狂降解皮肤结构性蛋白KRT14，进而引发人体皮肤病变。所以，接下来，怎么对症下药，怎么研究E3泛素连接酶家族其他成员，是不是又有一点点思路了呢？这里小编就不多说啦，大家有兴趣可以自行查阅文献哦~
参考文献：
Feng, C., Lin, Z., Li, S., Wang, H., Yang, Y., & Tan, X. (2017). 474 Stabilizing mutations of KLHL24 ubiquitin ligase cause loss of keratin 14 and human skin fragility. Journal of Investigative Dermatology, 137(5), S82.
