摧毁你的皮肤屏障—KLHL24基因突变研究（一）
生活中总能听到平民英雄的传说，其实在生物体内，也有着众多无名英雄为了维护我们身体的健康无时无刻不在默默无闻的工作着。KLHL24就是其中之一。
导语
常态下，生为泛素连接酶的KLHL24，一面引领着猎物-KRT14一步不回头地迈向深渊（蛋白酶体），一面又为维护人类的皮肤屏障不惜自行了断（自泛素化）。可惜世事无常，基因突变（Klhl24-∆N28）你能奈其所何？缺失了N端28个氨基酸的Klhl24仿佛进入癫狂，自律性的自我毁灭程序不再，无休止的消灭猎物才是终极目标，给原本立誓要保护的细胞和组织，造成毁灭性的打击。
大疱表皮松解症(epidermolysis bullosa，EB)是一种皮肤疾病，常见表现症状为皮肤在受到轻微摩擦或碰撞后出现水疱及血疱、糜烂， 好发于肢端及四肢关节伸侧，严重者可累及机体任何部位。其中遗传性EB的主要发病类型为单纯性EB（simplex EB，EBS），皮损最表浅，愈后一般不留瘢痕。皮肤结构性蛋白的损伤（如角蛋白）会造成皮肤脆弱，引发EB.
本文作者通过对EBS患者的基因突变分析为切入点，一步步解释了KLHL24显性突变如何引起EB的发生。
罪魁祸首-基因突变
通过对不同EB患者基因进行全外显子组测序，发现均出现KLHL24基因突变(Fig. 1a)。通过RT-PCR，证明KLHL24在人体各组织中广泛表达，包括皮肤 (Fig. 1b).
KLHL24属于Kelch-like 基因家族，该基因家族编码的蛋白具有一个高度保守的BTB结构域和BACK结构域，这些结构域可与CUL3和RBX1互作形成CUL3–RBX1–Kelch泛素连接酶复合物。 Kelch-like蛋白还具有一个Kelch结构域，用于招募底物，决定了E3连接酶的特异性。
KLHL24突变位于起始密码子区域，因而翻译无法正常起始，猜测Met29可能作为另一翻译起始位点。将携带正常KLHL24与KLHL24-∆N28质粒的转染细胞分别裂解进行免疫印迹，均发现目的蛋白的对应条带(KLHL24-∆N28; Fig. 1c)。
进一步验证KLHL24-∆N28翻译起始位点，在Met1突变情况下（ATA）将Met29密码子突变（ATG-ATA），最终发现KLHL24的表达受到抑制(Fig. 1d)，因此证明了Met29可以作为另一翻译起始位点。
Fig.1 KLHL24 start-codon mutations identified in the five patients result in an N-terminally truncated protein.(a) Sequence chromatograms showing heterozygous c.1A>G (patients 1, 2 and 5), c.3G>T (patient 3) and c.3G>A (patient 4) mutations, affecting the start codon.(b) Expression profile of human KLHL24 determined by RT–PCR, showing ubiquitous expression in representative adult tissues, including skin. (c) Expression of KLHL24 protein analyzed by immunoblotting in 293T cells transfected with the indicated constructs. (d) Expression of KLHL24 proteins analyzed by immunoblotting in 293T cells transfected with the indicated C-terminally GFP-tagged constructs and untransfected cells (–).
将KLHL24与KLHL24-∆N28在HaCaT（永生化人类角质细胞系）细胞中过量表达，发现KLHL24-∆N28的表达量远远高于正常型KLHL24 (Fig. 2a). 猜测可能是由于蛋白质的稳定性不同导致，因为mRNA水平与这种蛋白表达量的差异表现无关( Fig. 3)。
Fig 2. (a) Stably expressed KLHL24-N28 shows markedly higher protein levels than the wild-type protein. MG-132 treatment for 8h increases the protein levels of KLHL24 but not those of KLHL24-∆N28. (b-c) Measurement of the stability of wild-type and mutant KLHL24-∆N28 proteins by cycloheximide (CHX) chase assays.
Fig 3. Proteasome inhibitor MG132 treatment increased did not change the mRNA levels of KLHL24 in HaCaT cells stably expressing KLHL24 or KLHL-ΔN28. The mRNA levels were normalized to the mRNA level of KLHL24 in HaCaT cells expressing KLHL24 not treated by MG132
既然推测这种表达量差异与蛋白稳定性相关，如果加入蛋白酶抑制剂，结果会如何？
在蛋白酶抑制剂MG-132作用下，KLHL24的丰量大大提升，但KLHL24-∆N28并无明显变化(Fig. 2a)，同时，突变型KLHL24-∆N28 半衰期(t1/2 = ~4.6 h)经测定也远超正常型KLHL24 (t1/2 = ~0.4 h) (Fig. 2b,c）, 说明KLHL24-∆N28性质较野生型更稳定。
说也奇怪，明明少了一截，人生却像开了挂直接升级金刚不坏之身？这是何故？
结合以往研究，多数E3连接酶都会受到自泛素化调节，因此推测突变型与正常型KLHL24的稳定性差异可能也与自泛素化过程相关。
在表达CUL3, RBX1和 KLHL24的293T/ HaCaT转染细胞中，检测KLHL24的泛素化水平，发现KLHL24-∆N28较正常KLHL24泛素化水平低；
MLN4924通过抑制泛素化修饰可以提高KLHL24的丰量而突变型却保持不变。
免疫共沉淀实验表明，KLHL24和 KLHL24-∆N28与CUL3的结合能力相近，排除了KLHL24-∆N28稳定性增强是由于失去与CUL3 结合能力的可能性。
Kelch-like蛋白的二聚化影响其泛素化能力， 而GST和免疫共沉淀实验均表明，KLHL24-∆N28二聚化能力不受影响。
所有结果表明，突变体KLHL24-∆N28失去了自泛素化能力，从而提高了蛋白的稳定性及存在丰量。
说到底，身为泛素连接酶，指引底物奔赴黄泉也是职责所在。可亲密接触的时间这么短，怎么才能从“芸芸众生”中确认那个对的TA呢？
第一步：确认候选底物
单独表达KLHL24 Kelch结构域（Kelch结构域负责与底物结合）与GST融合蛋白，同时，为排除非特异性结合蛋白，以Kelch结构域突变体(Kelchmut)作为平行对照。将HaCaT细胞裂解液依次进行GST pulldown及质谱，确认了部分候选底物，初步质谱分析（Fig. 4c）表明，KRT14一枝独秀，很可能是KLHL24的底物。
进一步与对照组对比分析，最终发现KRT14可与KLHL24,KLHL24-∆N28结合（Fig. 4c,d,e）,而Kelchmut与KRT14的亲和力明显较低。
Fig4.(c) PSM (peptide spectrum match) score ratios for the proteins identified by mass spectrometry. (d) GST pulldown experiments indicate that GST-Kelch interacts with HA-KRT14. The two GST blots were cropped from the full-length blot shown in supplementary Figure 9c. (e) Coimmunoprecipitation experiments in HaCaT cells indicate that KRT14 interacts with KLHL24 and KLHL24-∆N28. (f) Immunofluorescent staining shows markedly reduced KRT14 levels in the basal keratinocytes of skin from patient 5 in contrast to normal skin.(g) Immunoblotting of skin samples shows a marked reduction in the amount of KRT14 in patient 5 in comparison to normal controls.
