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“无名英雄”癫狂模式启动摧毁你的皮肤屏障—KLHL24基因突变

2020.8.24

　　生活中总能听到平民英雄的传说，其实在生物体内，也有着众多无名英雄为了维护我们身体的健康无时无刻不在默默无闻的工作着。KLHL24就是其中之一。

　　导语

　　常态下，生为泛素连接酶的KLHL24，一面引领着猎物-KRT14一步不回头地迈向深渊（蛋白酶体），一面又为维护人类的皮肤屏障不惜自行了断（自泛素化）。可惜世事无常，基因突变（Klhl24-∆N28）你能奈其所何？缺失了N端28个氨基酸的Klhl24仿佛进入癫狂，自律性的自我毁灭程序不再，无休止的消灭猎物才是终极目标，给原本立誓要保护的细胞和组织，造成毁灭性的打击。

　　大疱表皮松解症(epidermolysis bullosa，EB)是一种皮肤疾病，常见表现症状为皮肤在受到轻微摩擦或碰撞后出现水疱及血疱、糜烂，好发于肢端及四肢关节伸侧，严重者可累及机体任何部位。其中遗传性EB的主要发病类型为单纯性EB（simplex EB，EBS），皮损最表浅，愈后一般不留瘢痕。皮肤结构性蛋白的损伤（如角蛋白）会造成皮肤脆弱，引发EB.

　　本文作者通过对EBS患者的基因突变分析为切入点，一步步解释了KLHL24显性突变如何引起EB的发生。

　　罪魁祸首-基因突变

　　通过对不同EB患者基因进行全外显子组测序，发现均出现KLHL24基因突变(Fig. 1a)。通过RT-PCR，证明KLHL24在人体各组织中广泛表达，包括皮肤 (Fig. 1b).

　　KLHL24属于Kelch-like 基因家族，该基因家族编码的蛋白具有一个高度保守的BTB结构域和BACK结构域，这些结构域可与CUL3和RBX1互作形成CUL3–RBX1–Kelch泛素连接酶复合物。 Kelch-like蛋白还具有一个Kelch结构域，用于招募底物，决定了E3连接酶的特异性。

　　 KLHL24突变位于起始密码子区域，因而翻译无法正常起始，猜测Met29可能作为另一翻译起始位点。将携带正常KLHL24与KLHL24-∆N28质粒的转染细胞分别裂解进行免疫印迹，均发现目的蛋白的对应条带(KLHL24-∆N28； Fig. 1c)。

　　进一步验证KLHL24-∆N28翻译起始位点，在Met1突变情况下（ATA）将Met29密码子突变（ATG-ATA），最终发现KLHL24的表达受到抑制(Fig. 1d)，因此证明了Met29可以作为另一翻译起始位点。

　　Fig.1 KLHL24 start-codon mutations identified in the five patients result in an N-terminally truncated protein.(a) Sequence chromatograms showing heterozygous c.1A>G (patients 1, 2 and 5), c.3G>T (patient 3) and c.3G>A (patient 4) mutations, affecting the start codon.(b) Expression profile of human KLHL24 determined by RT–PCR, showing ubiquitous expression in representative adult tissues, including skin. (c) Expression of KLHL24 protein analyzed by immunoblotting in 293T cells transfected with the indicated constructs. (d) Expression of KLHL24 proteins analyzed by immunoblotting in 293T cells transfected with the indicated C-terminally GFP-tagged constructs and untransfected cells (–).

　　将KLHL24与KLHL24-∆N28在HaCaT（永生化人类角质细胞系）细胞中过量表达，发现KLHL24-∆N28的表达量远远高于正常型KLHL24 (Fig. 2a). 猜测可能是由于蛋白质的稳定性不同导致，因为mRNA水平与这种蛋白表达量的差异表现无关( Fig. 3)。

　　Fig 2. (a) Stably expressed KLHL24-N28 shows markedly higher protein levels than the wild-type protein. MG-132 treatment for 8h increases the protein levels of KLHL24 but not those of KLHL24-∆N28. (b-c) Measurement of the stability of wild-type and mutant KLHL24-∆N28 proteins by cycloheximide (CHX) chase assays.

　　Fig 3. Proteasome inhibitor MG132 treatment increased did not change the mRNA levels of KLHL24 in HaCaT cells stably expressing KLHL24 or KLHL-ΔN28. The mRNA levels were normalized to the mRNA level of KLHL24 in HaCaT cells expressing KLHL24 not treated by MG132

　　既然推测这种表达量差异与蛋白稳定性相关，如果加入蛋白酶抑制剂，结果会如何？

　　在蛋白酶抑制剂MG-132作用下，KLHL24的丰量大大提升，但KLHL24-∆N28并无明显变化(Fig. 2a)，同时，突变型KLHL24-∆N28 半衰期(t1/2 = ~4.6 h)经测定也远超正常型KLHL24 (t1/2 = ~0.4 h) (Fig. 2b,c）, 说明KLHL24-∆N28性质较野生型更稳定。

　　说也奇怪，明明少了一截，人生却像开了挂直接升级金刚不坏之身？这是何故？

　　结合以往研究，多数E3连接酶都会受到自泛素化调节，因此推测突变型与正常型KLHL24的稳定性差异可能也与自泛素化过程相关。

　　在表达CUL3, RBX1和 KLHL24的293T/ HaCaT转染细胞中，检测KLHL24的泛素化水平，发现KLHL24-∆N28较正常KLHL24泛素化水平低；

　　MLN4924通过抑制泛素化修饰可以提高KLHL24的丰量而突变型却保持不变。

　　免疫共沉淀实验表明，KLHL24和 KLHL24-∆N28与CUL3的结合能力相近，排除了KLHL24-∆N28稳定性增强是由于失去与CUL3 结合能力的可能性。

　　Kelch-like蛋白的二聚化影响其泛素化能力，而GST和免疫共沉淀实验均表明，KLHL24-∆N28二聚化能力不受影响。

　　所有结果表明，突变体KLHL24-∆N28失去了自泛素化能力，从而提高了蛋白的稳定性及存在丰量。

　　说到底，身为泛素连接酶，指引底物奔赴黄泉也是职责所在。可亲密接触的时间这么短，怎么才能从“芸芸众生”中确认那个对的TA呢？

　　第一步：确认候选底物

　　单独表达KLHL24 Kelch结构域（Kelch结构域负责与底物结合）与GST融合蛋白，同时，为排除非特异性结合蛋白，以Kelch结构域突变体(Kelchmut)作为平行对照。将HaCaT细胞裂解液依次进行GST pulldown及质谱，确认了部分候选底物，初步质谱分析（Fig. 4c）表明，KRT14一枝独秀，很可能是KLHL24的底物。

　　进一步与对照组对比分析，最终发现KRT14可与KLHL24,KLHL24-∆N28结合（Fig. 4c,d,e）,而Kelchmut与KRT14的亲和力明显较低。

　　Fig4.(c) PSM (peptide spectrum match) score ratios for the proteins identified by mass spectrometry. (d) GST pulldown experiments indicate that GST-Kelch interacts with HA-KRT14. The two GST blots were cropped from the full-length blot shown in supplementary Figure 9c. (e) Coimmunoprecipitation experiments in HaCaT cells indicate that KRT14 interacts with KLHL24 and KLHL24-∆N28. (f) Immunofluorescent staining shows markedly reduced KRT14 levels in the basal keratinocytes of skin from patient 5 in contrast to normal skin.(g) Immunoblotting of skin samples shows a marked reduction in the amount of KRT14 in patient 5 in comparison to normal controls.

　　第二步：验证底物

　　首先测定KRT14蛋白含量，结果表明2位患者皮肤样品中的KRT14含量明显低于年龄相当的非患病对照组(Fig. 4f,g)。同时，与KRT14形成异二聚体的Keratin 5 (KRT5)含量也较对照组低，但keratin 1 (KRT1)含量没有发生变化（不与KRT14或 KRT5形成二聚体）。

　　角蛋白免疫荧光及皮肤分化标志物表明，患者基底层细胞中角蛋白大量减少，但基底上层角蛋白及分化标志物丰度保持不变(Fig.5)

　　Figure 5. IF staining of pan-keratin, KRT1, keratin10 (KRT10) and loricrin on skin sections of Patient 5 and a normal control.

　　HaCaT细胞中过表达KLHL24，会小幅度降低KRT14蛋白水平，而KLHL24-∆N28的过表达会使KRT14含量急剧降低(“input”in Fig.4e)；半衰期检测结果表明，KLHL24和KLHL24-∆N28过表达会使KRT14稳定性降低。

　　RNAi表明KLHL24下调会提升KRT14蛋白存在水平，而对于KLHL24-∆N28，当siRNA靶点位于编码区时可以提高KRT14含量，位于5'或3'UTR区域时则无明显变化。

　　进一步检测293T细胞中KRT14泛素化水平，观察到KLHL24 或KLHL24-∆N28瞬时表达后与CUL3 和RBX1结合可提高KRT14的泛素化水平。

　　综合以上基因分析及生化实验结果可知，KLHL24可作为E3泛素连接酶作用于底物KRT14，其功能获得性突变体KLHL24-∆N28会导致底物KRT14的过度降解使皮肤完整性受损。

　　 OK，现在我们知道了，患者之所以发生皮损，原来是角蛋白KRT14非正常大量降解所致，而这背后真正的魔手，归结于KLHL24突变。

　　既然KLHL24这么重要，追本溯源，那么它会不会也参与角朊细胞的分化过程呢？

　　为了研究KLHL24在皮肤分化中的调节作用，作者使用钙开关诱导小鼠角朊细胞分化模型。研究发现：

　　Klhl24编码的mRNA在分化过程中大幅提高，在一定程度上与角质细胞的分化标志物Lor， Krt10相近.

　　Krt14蛋白含量随分化大幅降低，而其mRNA水平却出现小幅度上升，表明在此过程中出现了蛋白降解。

　　据以往研究报道，Klhl24的表达可能会有转录因子p73的参与，而p73随着角质细胞的分化也会出现表达上调。

　　通过FISH，发现在正常和病人来源的皮肤样本中，基底层角质细胞较基底上层角质细胞的KLHL24表达量更低，而KRT14的含量则与此相反(Fig. 6)。

　　Figure 6. KLHL24 mRNA FISH experiment in skin samples of Patient 5: KLHL24 mRNA FISH (Magenta), KRT14 IF (Green). Arrows: upper periphery of the basal layer. Dot plot: quantification of the FISH intensity of the keratinocytes’ cytoplasmic area with positive or negative KRT14 staining respectively.

　　综上，表明在角朊细胞分化过程中， KLHL24表达上调并扮演了清除KRT14的角色。

　　体外研究告一段落，也是时候上活体小鼠模型了。

　　利用CRISPR/Cas9技术构建杂合子(Klhl24c.3G/T)及纯合子(Klhl24-/-)基因编辑小鼠（Fig.7d）（此模型小鼠由百奥赛图供应，可以荣登Nature期刊也是荣幸之至，荣幸之至啊）

　　形态学方面：

　　Klhl24c.3G/T小鼠与野生型同窝鼠仔相比，呈现出更明显的与年龄相关的脱发，减重及体型小症状（Fig.7e），但是Klhl24-/-却表型正常。杂合子(Klhl24c.3G/T)及纯合子(Klhl24-/-)小鼠均没有表现出皮肤脆性。

　　蛋白表达方面：

　　提取Klhl24c.3G/T ，Klhl24-/ -mice及野生型小鼠皮肤和大脑组织进行免疫共沉淀，免疫印记实验。发现皮肤组织中并无任何条带，大脑组织中则在Klhl24c.3G/T中检测到Klhl24-∆N28条带（Fig.7f）。这些结果和Human Protein Atlas的研究发现相符，即Klhl24在大脑组织中的表达量高于皮肤组织。

　　Fig7. (d) Illustration of the CRISPR/Cas9-mediated knock-in and knockout strategies. (e) Photograph of a 20-weekold Klhl24c.3G/T male mouse (left) and its wild-type male littermate (right). (f) Cerebral tissue extracts from a Klhl24c.3G/T mouse, its wild-type littermate and a Klhl24-/ -mouse were immunoprecipitated with an antibody to KLHL24 followed by immunoblotting.

　　同时，Klhl24c.3G/T小鼠皮肤样本中，Krt14含量较野生型降低(Fig. 7g–i)，降低程度显著但仍高于患者皮肤Krt14含量，此现象在一定程度上解释了Klhl24c.3G/T小鼠为何没有皮肤脆性表型。

　　Fig7. (g) Immunoblotting using skin extracts shows a reduction in Krt14 protein levels in Klhl24c.3G/T mice in comparison to a wild-type littermate. (h) Quantification of the relative intensity of the Krt14 bands for Klhl24c.3G/T mice (n = 5) and their wild-type littermates (n = 11) from five independent experiments.(i) Immunofluorescence of Krt14 in skin sections from a Klhl24c.3G/T mouse and its wild-type littermate.

　　划重点

　　KLHL24可以作为E3泛素连接酶对底物KRT14进行泛素化修饰，并发现其获得性功能突变体可以导致KRT14的大幅度降低并引发人类的皮肤脆性病症（Fig.8）

　　Figure 8. Schematic of the disease-causing mechanism of KLHL24 mutations. (a) Under normal condition, KLHL24 protein is tightly controlled by autoubiquitination and turnover of KRT14 by CUL3–RBX1–KLHL24 is at a low level. (b) In the EBS cases we found, KLHL24-∆N28 is stabilized through abolished autoubiquitination. Overstabilized mutant KLHL24 leads to excessive ubiquitination and degradation of KRT14.

　　角朊细胞分化时， KLHL24的诱导表达及其对KRT14的泛素化修饰可能参与其中，而KLHL24的自泛素化可以防止KRT14的过度下降，从而提供了一层安全保障。

　　在EB的疾病表型方面，人类和相应的小鼠模型会存在一定差异；在我们的研究中，KLHL24起始密码子突变会导致KRT14含量不同程度的降低，以及在人和小鼠中不同的皮肤疾病表型，至于为何会出现这种差异，还有待进一步研究。

　　结语

　　失去了N端28个氨基酸，就可以导致KLHL24性情大变疯狂降解皮肤结构性蛋白KRT14，进而引发人体皮肤病变。所以，接下来，怎么对症下药，怎么研究E3泛素连接酶家族其他成员，是不是又有一点点思路了呢？这里小编就不多说啦，大家有兴趣可以自行查阅文献哦~

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