采用 RNA ScreenTape 分析法进行 DV200 评估
Eva Graf
安捷伦科技有限公司
Waldbronn, Germany
摘要
RNA 测序文库制备工作流程的成功与否在很大程度上取决于 RNA 起始材料的质量。采用 Agilent RNA ScreenTape 分析法获得的 RNA 完整值当量 (RINe) 是一种评估标准 RNA 测序的样品完整性的可靠且可重现的指标。由于 RNA 降解以及样品体积有限，从福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织中提取 RNA 样品进行文库制备具有挑战性，因此建议针对 FFPE RNA 文库制备采用定制方案。FFPE RNA 样品的片段大小分布对文库产率具有重要影响，可以将其描述为大于 200 个核苷酸的 RNA 片段所占的百分比，用 DV200 质量指标来表示[1]。Agilent RNA ScreenTape 和安捷伦高灵敏度 RNA ScreenTape 分析法有助于对从 FFPE 组织中提取的降解 RNA 样品进行高可重现的 DV200 评估。Agilent TapeStation 分析软件能够通过区域分析对 DV200 数据进行简单评估和处理，自动进行重复 DV200 分析。
技术详情
使用配有 Agilent TapeStation 分析软件（A.02.02版）的 Agilent 4200 TapeStation 系统。RNA ScreenTape（部件号 5067-5576）和试剂（部件号 5067-5577 和5067-5578），以及安捷伦高灵敏度 RNA ScreenTape（部件号 5067-5579）和试剂（部件号 5067-5580 和 5067-5581）均购自安捷伦科技公司。除非另有说明， 否则所有分析均按照生产商的方案和指南进行。采用 ScreenTape 分析法对所有样品进行分析，每个胶条包含梯度分子量内标上样。从 FFPE 组织中提取的 RNA 样品由国家肿瘤疾病中心（简称 NCT，位于德国海德堡）组织库友情提供，此过程符合组织库的规定，并得到了海德堡大学伦理委员会的批准。
数据分析
DV200 表示大于 200 个核苷酸的 RNA 片段占所有 RNA 片段的百分比。通过定义大于 200 个核苷酸的区域，可以利用 TapeStation 分析软件计算得出 DV200。该软件提供了区域设置的多种方式，适用于从低到高的各种样品通量。如需了解更多信息以及关于区域分析的演示视频，请咨询安捷伦信息中心(AIC)。
单个样品的区域设置
为单个样品定义 DV 200 区域，请单击 Region，然后右键单击电泳图以添加区域。可以通过向左或者向右滑动来单独调节区域边界。
数据文件的区域设置
如果要将 DV 200 区域定义为默认适用于单个数据文件中所有样品，请单击 Region，然后单击 Region Settings，在对话框中输入区域下限和上限（图 1）。如需在电泳图中识别该区域，请输入DV200 作为区域注释。要将该区域应用于现用文件中的所有样品，请选择 This File。
自动区域设置
要将 DV200 区域定义为默认适用于所有重复的 FFPE RNA 样品分析，请单击 Region，然后单击 Region Settings，在对话框中输入区域下限和上限（图 1）。如需在电泳图中识别该区域，请输入
DV200 作为区域注释。要将该 DV200 区域应用于与现用文件分析方法相同的所有文件，请选择 Assay Files。
DV200 区域定义完成后，每个样品的值将显示在区域表中的 % of Total 列（图 2）。可以通过选中区域表，导出所有区域数据并生成报告。请注意，TapeStation 分析软件的区域表、导出文件和报告中显示的浓度，是指所定义区域的浓度；总样品浓度显示在样品表中。
结果与讨论
重现性
对三个 FFPE RNA 样品进行五次独立重复测定，以对采用 RNA 和高灵敏度 RNA ScreenTape 分析法获得的 DV200 重现性进行验证。两种方法均表现出较高的重现性，CV 小于 5%（图 3）。
浓度依赖性
采用 RNA 和高灵敏度 RNA ScreenTape 分析法对三个单独 FFPE RNA 样品的系列稀释溶液进行分析，以确定 DV200 分析的一致性（表 1）。RNA ScreenTape 分析法和高灵敏度 RNA ScreenTape 分析法获得的 DV200 均表现出较高的精确度，其CV 值小于 5%。
如图 4 所示，系列稀释溶液分析表明， 当测量浓度高于特定分析浓度范围下限时，DV200 评估是最精确的。
严重降解的 FFPE 样品可能会下移到靠近下位分子量内标处，而不能完全与下位内标分离，特别是在样品浓度接近特定定量范围上限时。在这种情况下，稀释样品产生的 DV200 结果更为准确（见图 5）。
分析方法比较
采用 RNA ScreenTape 分析法对来自不同人体组织的 20 个 FFPE RNA 样品进行分析，然后将样品按 1:20 的比例稀释，再用高灵敏度 RNA ScreenTape 分析法进行分析。RNA 分析法获得的 DV200 范围为 40%–74%，而用高灵敏度 RNA 分析法分析相应样品的结果为这些值的 101±5%。为了验证 RNA 和高灵敏度 RNA ScreenTape 分析法测得的 DV200 的可比性，将两种方法得到的值绘制在一起，如图 6 所示。
结论
Agilent RNA 和安捷伦高灵敏度 RNA ScreenTape 分析法，结合 Agilent 4200 TapeStation 系统，可以轻松快速地对FFPE RNA 样品进行质量分析。Agilent TapeStation 分析软件在进行区域设置后 DV200 以总百分比显示。RINe 算法不会影响 DV200 的计算。由 RNA 和高灵敏度 RNA ScreenTape 分析法计算得到 DV200 具有较高的重现性，两种方法得到的结果 高度一致。为了获得最佳性能，建议与样品一起进行梯度分子量内标分析。在特定分析范围内，系列稀释溶液的 DV200 具有一致性。对于未能与内标有效分离的高度降解样品，应对其进行稀释以获得最准确的结果。
