PCR实验室SOP文件（八）
实验台摆放规范
1.目的：使实验操作过程达到最优，保证检测工作的正常进行。
2.适用范围：核酸扩增荧光检测实验室中用来处理样品的实验台及置于其上的实验用具，包括移液器架、标本架、吸头盒、离心管架等物品。
3.职责：本室工作人员应自觉遵守，由实验室负责人监督执行。
4.摆放规范：核酸扩增荧光检测实验室中用来处理样品的实验台上各种物品的摆放必须遵照一定的规则(如下图)。实验物品须排放整齐，实验过程中不宜随意移动，要区分相对洁净区和相对污染区。
4.1 做实验前实验台面的摆放应如图1所示
说明：移液器架上从左到右放200～1000 l、20～200 l、5～50 l、0.5～10 l的移液器；移液器架左边摆放离心管架和弃液缸，是相对污染区；枪架右边摆放常用实验试剂（ 如生理盐水、NaOH等）和枪头盒，是相对洁净区。
4.2 做实验时实验台面的摆放应如图2所示
说明：做实验时，枪头盒放置枪架旁；弃液缸移至右手易打掉枪头的位置 （注意与吸头盒和移液器架隔开一定的距离，实验后其摆放位置用75%酒精擦拭）；标本在正前方处理。
核酸扩增及产物分析检测的操作程序
1.目的：PCR检测是整个临床基因扩增检验最主要的过程，为使该过程有序、
在控，特制订本程序。
2.范围：PCR检测---样本处理、核酸提取、纯化、扩增产物分析整个过程。
3.职责：本程序由PCR实验室工作人员负责执行。
4.工作流程：
4.1 核酸提取、纯化、扩增、产物分析的具体操作见项目SOP文件及仪器使用
SOP文件。
注：目前，SOP文件的主要依据是生产厂家提供的检测试剂盒说明书。
4.2 核酸提取、纯化在标本制备区完成。
4.3 在二区处理好的模板放入4℃冰箱保存。
4.4 扩增反应体系的配制、分装在试剂准备区完成后，由传递窗样本处理区，添
加模板后，将处理后的标本放入通往三区的传递窗。
4.5 扩增程序的编程：日常检测活动中，操作者必须遵循仪器使用SOP文件规定
的路径。编程或修改路径参照仪器说明书。
4.6 标本标识的传递：以标本唯一性标识中的“序号”作为检测过程中的“检验
号”进行传递。
4.6.1 试管或其它盖体分离的容器，检验号标识于管身上1/3处。
4.6.2 对于0.5ml, 1.0ml Eppendoff管，检验号标识于管盖。
4.6.3 扩增使用的薄壁管不能做任何标识，检验号由试管架上的标识传递到扩增
仪转轮标识号上，并且一一对应。
4.7 工作安排：每一项目每周至少完成一个批次的检测。
4.8 在移取所需体积的血清及痰液后，立即盖紧原始标本管盖，将标本继续保存
于与原来对应的条件下保存。
4.8.1原始标本保存一周后丢弃,因此申明“如果病人对结果有疑义请在一周内提出,以便及时核查”。
4.8.2如患者及医生对标本结果有异议，则需在一周内及时提出意见，以便重新
检测复核结果。
5.引用的文件：
乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测标准操作程序
乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准
操作程序
1.目的：明确乙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测。
2.适用范围：
2.1适用于进行乙肝病毒核酸定量检测的检验人员。
2.2适合仪器：LightCycler型核酸扩增荧光检测仪
2.3方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术
2.4样品要求：血清
3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
4.试剂来源：中山大学达安基因股份有限公司HBV DNA荧光PCR检测试剂盒。
5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒
6.标准操作：
6.1 试剂准备（在试剂准备区操作）
6.1.1将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（Taq酶为液态试剂，临用前取出，用后立即放回冰格），完全融解后混匀。
6.1.2根据当次实验标本量，取出相应试剂总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1管阴性对照+1管阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品)（定性检测无需做阳性参控品）， 取PCR反应管，转移至样本制备区。
6.2 样本制备及加样（在标本制备区操作）
6.2.1
取血清标本40ul，或阴阳性对照标准品各10ul（强阳性标准品使用前加入稀释液90ul混匀），加等量DNA提取液打匀，（提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后填满吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截）。沸水浴10分钟，转至4℃静置8-12小时以保证病毒颗粒充分裂解。
6.2.2 10000rpm离心5分钟，取上清液2ul直接加入到PCR反应管中，6000rpm离心数秒。
6.2.3 将各反应管带入PCR仪。
6.3 PCR扩增（在扩增区操作）
按仪器使用说明或标准操作程序操作。
扩增条件如下：93℃→2分钟预变性
93℃ 30秒 → 55℃ 60秒（40个循
