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分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

双脱氧法DNA测序实验——α-标记核苷酸进行热循环测序反应

2019.3.25
实验材料

DNA

试剂、试剂盒

DNA测序缓冲液dATPDNA聚合酶

仪器、耗材

热心换反应装置离心机

实验步骤

1.  对应于毎个待测模板，分别以A、G、C、T 标记好4个微量离心管。

2.  分别往标好A、G、C、T 的管子中，加A、G、C、T 测序混合液各3 μl。

 

3.  对于单链模板：在0.5 ml 微量离心管中混匀下列试剂

（1）0.04 pmol 单链DNA模板

（2）0.6 pmol 引物

（3）1.5 μl 10×VentR（exo-）测序缓冲液

（4）1 μl 3%Triton X-100

（5）加水至12 μl

（6）用吸管上下抽吸轻轻混匀溶液。

4.  对于双链DNA模板： 在0.5 ml 微量离心管中混匀下列试剂

（1）0.1 pmol 双链DNA模板

（2）1.2 pmol 引物

（3）1.5 μl 10×VentR（exo-）测序缓冲液

（4）1 μl 3%Triton X-100

（5）加水至12 μl

（6）通过用吸管上下抽吸，使溶液混匀。

5.  毎个模板/引物混合物加1~2 μl 10 mCi/ml［α-35S］dNATP、［α-32P］dNATP或［α-32P］dNATP，用吸管轻轻上下抽吸混合溶液。

6.  经步骤5操作后的管子，加入1 μl 2 000 U/ml 的VentR（exo-）DNA聚合酶。

 

7.  立即往步骤2的含VentR（exo-）测序混合物A的管子中加入3.2 μl 步骤5操作后所得的混合物。

8.  分别重复此过程于C、G、T管，每次均换吸头，反应混合物，置于冰上。

9.  往每个反应混合物上滴入1滴无菌矿物油。

10.  在热循环反应装置中设定如下反应条件：20循环：20 s，90℃；20 s，55℃；20 s，72℃反应管放入热循环仪中，启动程序。

11.  在矿物油层下加入4 μl TCS终止/加样染料。

 

12.  样品在85℃温育3 min。

13.  将吸管头插入覆盖矿物油层下面的反应物中，取2 μl 加样于测序胶进行电泳，并读出序列。


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