多色纤维荧光原位杂交实验
| 实验方法原理 |   |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 培养细胞悬液PBS晕圈溶液牛血清白蛋白乙醇醚10 X 切口缓冲液核苷酸混合物Bio-16-dUTP二硫苏糖醇酵母 RNA鲑鱼精 DNASSCTNT 溶液TNB 溶液 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、制备含 DNA 纤维的载玻片标本大多数类型的细胞，只要保持没有固定或干燥且细胞核完整，都适于做纤维 FISH 分析。冻存组织标本和沉淀的细胞团块，只要组织能重新悬起成细胞悬液，就还可以使用。有大量细胞质的细胞需要更剧烈的处理以使其裂解。一般情况下都是先采用最温和的方法，如果裂解不充分，就增加 SDS 的处理。 制备开始前，将下列物品放置在冰上： 1.每种晕圈溶液和超纯水配制的 0.05%SDS 溶液分别放入 IOOmL 烧杯中，另外两个 IOOmL 烧杯分别装超纯水。 2.一个试管装 20%BSA，另一个试管装 PBS。 3.玻璃板（5 mm 厚）。 制备细胞悬液适用于培养的细胞，外周血细胞或者其他细胞悬液： 1.将 ImL 细胞悬液或胰酶消化的细胞（10000?100000 个细胞）装在 Eppendor 僧中，用微量离心机离心数秒钟。 2.弃上清。 3.将细胞重悬于 20(^LPBS 中（4°C)。 适用于冰冻组织： 1.切一片或几片 45；xm 厚度的冰冻组织片（见注释 3)。 2.装在 Eppendorf 管中，置于干冰上。 3.使用前一直放置在干冰上。 4.融化组织 30s 左右。 5.加入大约 50(VLPBS(4°C)。 6.剧烈上下抽吸碎组织片至形成悬液。 制备 DNA 纤维载玻片1.取 20pL 细胞于离心管中，加 PBS(4°C) 至 47.5pL，加入 2.5^20%BSA/PBS 溶液，混合均匀。 2.取上述悬液滴到标本上，用吸头将液体均匀的铺在整张载玻片上。 3.将载玻片放置在冰冷的玻璃板上 2 min。 4.将载玻片（磨砂边朝上）垂直立在纸上沥去多余的液体。 5.用压缩空气缓慢风干直到片子边缘干燥（外周血细胞和培养细胞等容易裂解的细胞，可省略步骤 6?9)(见注释 4)。 6.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液 1 中 30s。 7.大约用 3s 时间从溶液中缓慢取出片子，然后用 7s 的时间用纸吸干多余的液体（见步骤 4)。 8.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液 2 中 30s。 9.大约用 3s 时间缓慢取出片子，然后用 7s 的时间用纸吸干多余的液体（见步骤 4)。 10.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液 3 中 45s。 11.大约用 3s 时间缓慢取出片子，然后用 7s 的时间用纸吸干多余的液体 (见步骤 4)。 12.用纸擦净片子背面。 13.将片子水平放置在在冰冷的玻璃板上。 14.将湿片子放置在 UV 灯下，保持 1?IOcm 的距离（见注释 5)。 15.立即用 254nm 波长照射 1?IOmin(见注释 6)。 16.将片子垂直放置在纸上 IOs(见步骤 4)。 17.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液 4 中 30s。 18.大约用 3s 时间缓慢取出片子，然后用 7s 的时间用纸吸干多余的液体 (见步骤 4)。 19.轻轻地将片子垂直浸泡在晕圈溶液 5 中 30s。 20.用大约 3s 时间缓慢取出片子，然后用 7s 的时间用纸吸干多余的液体 (见步骤 4)。 21.用超纯水洗 2 次。 22.垂直将片子立在架子上使其干燥，室温放置数分钟。 23.用荧光显微镜 16 倍物镜和 TRITC 滤光片（见注释 6) 观察片子以及检查是否（a) 细胞适度裂解（图 1C)(见注释 7);(b) 细胞的数目足够（图 1D)(见注释 8);(c) 彗星状结构的（即纤维）数目足够（图 1E)(见注释 8)。 24.杂交前放置在室温过夜干燥；要放在密闭的容器中一 20°C 可长期保存。 二、探针标记1.在离心管中配制以下混合物：5juL10X 切口缓冲液、5^L0.1m 〇 l/LDTT、知 L 核酸混合物、0.5^L 已标记的核苷酸、ljugDNA，用超纯水调整体积至 44，。 2.将混合物放置在冰上，加 I1ULDNA 聚合酶。 3.用冰冷的超纯水按 1:500/1:1000/1:2000 梯度稀释 DNaseI 储存液。 4.加入 5pL 稀释的 DNaseI。 5.16°C 孵育 2 h。 6.将反应体系放在冰上，取 5pL 用 2% 琼脂糖凝胶检测片段大小（见注释 9)。 7.加入 20.jugssDNA 和 20jLig 酵母 RNA。 8.加入 0?1 倍体积的 3mol/LNaAc 和 2.5 倍体积的一 20°C 无水乙醇沉淀 DNA。 9.冰水混合物上放置 30 min。 10.用微量离心机以最大转速离心 30 min，去掉乙醇并空气干燥沉淀物。 11.用杂交混合液重悬探针，浓度为 30?60ng/jaL，37°C 溶解 30 min，避光储存（4°C 或一 20°C)。 三、杂交1.将含有纤维的载玻片在 80°C 玻片电热板上烤 2 h(见注释 10)。 2.制备探针混合物：每种标记的黏粒/PAC/P1 探针 3ng/VL 和每种探针加 50 倍过量的 Cot-1DNA 并加杂交混合液至 KVL。 3.探针混合物在 80°C 变性 8 min。 4.冰上放置 2 min 退火。 5.混匀，以微量离心机稍离心。 6.37°C 水浴预复性探针 30 min。 7.将 12(^L 变性混合液（70% 去离子甲酰胺/2XSSC/50 mmol/L 硫酸葡聚糖）加到 24 mmX60 mm 盖片上。 8.将载玻片有纤维一面覆盖到盖片上，使变性混合液自然展开。 9.翻转载玻片，使盖片一面朝上，将载玻片放在 80°C 电热板上精确地加热 3 min。 10.轻轻彳顷斜载玻片，使盖片自然滑脱。 11.冰上用 2XSSC(4°C) 洗 2 min。 12.用 70% 乙醇（一 20°C) 洗 5 min。 13.室温下依次用 90%、100% 乙醇脱水。 14.将标本垂直放置在架子上，气干。 15.将 IO^L 探针混合物加到载玻片上。 16.盖上 24 mmX24 mm 盖片。 17.正面朝下于 37°C 湿盒中杂交过夜。 四、杂交后洗脱和免疫检测于 37°C 水浴中预热 400 mL2XSSC: 1.在盛有 37°C2XSSC 染色缸中浸泡 5 min，使盖片自然滑落（见注释 11)。 2.37°C 下 2XSSC 中洗 3 次，每次 5 min。 3.TNT 溶液中洗 5 min。 4.将 120^LTNB 溶液加到 24 mmX60 mm 盖片上，将片子有纤维的一面覆盖到盖片上。 5.正面朝下于 37°C 湿盒中孵育 20 min。 6.制备 I:1000 鼠抗地高辛抗体和以 TNB 溶液稀释的 I:100 德克萨斯红标记的链霉亲和素，每张载玻片 12 〇 iuL。 7.在 TNT 溶液中洗脱盖片。 8.将抗体混合物加到 24 mmX60 mm 盖片上，反转载玻片覆盖到盖片上。 9.正面朝下于 37°C 湿盒中孵育 20 min。 10.在 TNT 溶液中洗脱盖片。 11.TNT 溶液洗 3 次，每次 5 min。 12.以 TNB 溶液配制 1:1000FITC 标记的兔抗鼠抗体和 1:100 生物素化山羊抗链霉亲和素抗体，每张载玻片 12 〇^L。 13.将抗体混合物加到 24 mmX60 mm 盖片上，反转载玻片覆盖到盖片上。 14.正面朝下于 37°C 湿盒中孵育 30 min。 15.以 TNB 溶液配制 1:100FITC 标记的山羊抗兔抗体和 1:200 德克萨斯红标记的链霉亲和素，每张载玻片 120/iL。 16.在 TNT 溶液中洗脱盖片。 17.TNT 溶液中洗 3 次，每次 5 min。 18.将抗体混合物加到 24 mmX60 mm 盖片上，反转载玻片覆盖到盖片上。 19.正面朝下于 37°C 湿盒中孵育 30 min。 20.在 TNT 溶液中洗脱盖片。 21.TNT 溶液中洗 3 次，每次 5 min。 22.依次用 70%、90%、100% 乙醇系列脱水。 23.空气干燥。 24.加 IO1^L 抗淬灭剂到载玻片上，盖上 24 mmX60 mm 盖片。 五、信号观察与结果判读载玻片上的背景非常高是由于探针的片段太长，然而，这种背景是很容易与线性排列的串珠状纤维区分开（图 1E)。根据 Vaandrager 等的方法对 FISH 信号进行分析 [11]。已知的探针间距离和（或）探针长度（如通过限制酶酶切作图或脉冲场凝胶电泳所获得的）提供了内部的长度参照 [14]。不同载玻片上 DNA 凝集程度的不同可以使用数字化图像的计算机辅助延伸和压缩加以消除，以达到正常条形码的全长。当出现诸如断裂导致的异常条形码时，来自于正常等位基因的正常条形码信号的存在可证实其杂交效率。定位断裂点所必需的全部纤维的数量依赖于最初细胞悬液中肿瘤细胞的数量。然而，通常通过测量 5 个正常与异常的条形码残基就可以准确定位断裂点 [14] 注释1.尽管许多载玻片的表面处理都适合进行纤维 FISH，但就我们的经验来看，特殊的涂层处理是不必要的。 2.建议采用柱子纯化探针 DNA 用于缺口平移，因为 DNaseI 对很少量的苯酚、盐和 RNA 的污染非常敏感。 3.可以将标本切成几片并于一 70°C 保存至两个月。每次实验需要的切片数量依赖于裂解细胞所使用的条件，剧烈的裂解可从载玻片上脱落更多的细胞。 4.使载玻片保持水平会有彩虹样水印产生。 5.UV 照射使 DNA 产生缺口。照射过量会产生小的 DNA 片段，这些片段会从片子上脱落；而照射剂量太小，将导致仅有很少信号的无效杂交。因此，每次在实验前经常确定适当的照射剂量事实非常重要的，采用从 1?IOmin 变换照射时间长度以及从 1?IOcm 变换 UV 灯与载玻片之间的距离。也可以使用 Strata-Iinker 装置。切记在 UV 照射的全程需要对眼睛和皮肤采取适当的保护措施。 6.不要盖盖玻片，也不要使用油。 7.应该出现彗星状的结构（图 1E)。若细胞核仍呈亮红色球状，则表明裂解不充分（图 1C)。这种情况下需进行以下步骤：将载玻片慢慢垂直浸泡在 0.05%SDS 中 10?30s，沥尽过量液体，将载玻片在晕圈溶液 1 中浸泡 IOs 后继续步骤 10。但是 SDS 常常造成固定在载玻片上的细胞脱少，这种情况下，也应该用更多的细胞或者使载玻片更干燥。载玻片越干燥，裂解就越困难，所以应注意标本不要太过干燥。 8.当整张载玻片都出现彗星状的结构以及排列整齐时，表明纤维数量是足够的（图 1E)。如果载玻片呈云雾状，而且可见亮的晶体状物质，就表示细胞数量太高了，应该减少细胞的数量（图 1D)。如果整张载玻片完全是黑的（除了杂质），那么就应该在步骤 3 后检查细胞悬液，确认有细胞存在。如果在悬液中很容易观察到细胞，那就有可能裂解步骤时细胞脱落了，则应跳过步骤 5, 直接在步骤 6 中吹干载玻片，如可以完全吹干上半部，保留潮湿的下半部，然后用晕圈溶液 3 处理。如果采用上述步骤后细胞还是裂解不充分，那只有重新离心细胞悬液，弃上清后用 50?IOOjULFCS 重悬细胞并于一 70°C 冻存过夜，然后快速融化并从步骤 3.I.1 开始重做实验。 9.探针用生物素和（或）者地高辛标记，理想的探针片段大小为 400~800bp。探针片段的大小可以采用标准的缺口平移程序通过调整 DNaseI 的用量加以控制。可用 2% 琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，并以生殖细胞纤维进行检测。标记后，沉淀探针并溶于杂交混合液中，可以同时混合多个探针而不改变杂交条件。 10.室温下干燥过夜或者经一 20°C 保存的载玻片都可以使用。 11.任何时候都不要使用外力剥离盖玻片，应该在染色缸中浸泡自然脱离。 |
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