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m6A修饰的YTHDF1与介导EIF3C对卵巢癌进展的影响（二）

2021.3.08

为了全面探索YTHDF1及其靶基因之间的直接相互作用，作者对过表YTHDF1的A2780细胞，进行了eCLIP-seq，并鉴定了2,343个目标转录物，这些转录物大多数是mRNA。将eCLIP seq的结果2,343个基因和上面三组数据交集确定的647个基因取交集，产生175个基因，将其确定为YTHDF1的直接结合靶基因。接下来，作者分析了175个基因上，m6A峰和YTHDF1结合mRNA上的eCLIP峰的分布。作者发现这些转录本中的大多数YTHDF1结合位点（包括EIF3C）都与m6A位点非常吻合。GO分析表明，结合YTHDF1的转录本与翻译调控最密切相关。EIF3C是真核转录起始因子EIF3的亚基之一，其翻译控制有助于肿瘤发生。此外，EIF3C与多种癌症（包括肝细胞癌，结肠癌和乳腺癌）的恶性行为相关。CLIP-qPCR还显示YTHDF1最显著富集EIF3C mRNA。这些数据表明EIF3C是YTHDF1在卵巢癌细胞中的直接靶标。

图4 YTHDF1靶基因鉴定m6A测序数据展示

5. YTHDF1调节卵巢癌细胞中EIF3C的表达和整体蛋白合成

为了确认YTHDF1调节卵巢癌细胞中EIF3C的表达，作者沉默YTHDF1后，探究了EIF3C的转录和翻译水平。如预期的那样，YTHDF1沉默可降低EIF3C的蛋白质丰度，而不会影响EIF3C的mRNA水平。接着，利用RIP-qPCR（云序提供此服务）证实了YTHDF1和EIF3C mRNA之间的相互作用。然后，作者针对YTHDF1和EIF3C mRNA的结合位点设计突变（YTHDF1-mut），RIP-qPCR发现YTHDF1突变体与EIF3C mRNA之间的相互作用显著降低。蛋白质印迹分析显示，YTHDF1-wt可以增强EIF3C的表达。
由于EIF3C是蛋白质合成所必需的EIF3复合物的关键亚基，因此作者接下来探讨了YTHDF1是否会影响卵巢癌细胞的整体蛋白合成。为了测试这一点，作者使用HPG掺入法分析新蛋白质的合成。与对照细胞相比，EIF3C敲低后掺入到合成蛋白中的HPG在下降。同样，与对照细胞相比，YTHDF1沉默的细胞也显示HPG信号下降，这表明YTHDF1可以影响整体蛋白质合成。总的来说，这些数据表明YTHDF1通过调节卵巢癌细胞中的EIF3C蛋白表达来影响整体蛋白合成。

图5 YTHDF1以m6A依赖性方式调节EIF3C翻译

6. 回补EIF3C可改善YTHDF1沉默对卵巢癌细胞的抑癌作用

作者检测卵巢癌组织中EIF3C的蛋白表达，发现EIF3C在卵巢癌中的蛋白表达显著升高。

EIF3C敲低后，细胞生长、集落形成能力、细胞迁移和侵袭均受到明显抑制。这些结果表明，EIF3C促进了卵巢癌的肿瘤发生。接着，作者在沉默YTHDF1的A2780和SKOV3细胞中过表达EIF3C，YTHDF1沉默会抑制细胞生长、集落形成、细胞迁移和侵袭，而EIF3C的回补则可以逆转这种抑制作用。这些结果表明，EIF3C是YTHDF1促进卵巢癌进展的关键下游靶标。最后，作者分析了卵巢癌组织中EIF3C蛋白表达与YTHDF1蛋白表达之间的相关性，发现YTHDF1的蛋白质丰度与EIF3C的表达呈正相关。以上结果显示，YTHDF1表达增加可以调节EIF3C翻译进而增强整体蛋白质合成，并促进卵巢癌细胞的肿瘤发生。

图6 YTHDF1依赖EIF3C促进卵巢癌细胞的生长和迁移

总结：

M6A甲基化是哺乳动物mRNA中含量最丰富的RNA修饰，越来越多的证据表明m6A在人类肿瘤发生中起着关键作用。本文，作者利用RNA-seq、MeRIP-seq和RIP-seq等多种技术联合分析，发现甲基化识别蛋白YTHDF1的直接靶点--蛋白质翻译起始因子eIF3的一个亚基EIF3C。YTHDF1通过与m6A修饰的EIF3C mRNA结合，以m6A依赖的方式增加EIF3C的翻译，同时促进整体蛋白合成，从而促进卵巢癌的发生和转移。本文确定了对卵巢癌进展至关重要的新的YTHDF1-EIF3C轴，为开发癌症治疗提供新的靶点。

图7 YTHDF1介导的EIF3C翻译在卵巢癌中的作用

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