环状RNA研究的方法及功能作用（二）
RNA是怎样变成环状的呢？
a. 在可变剪切过程中，外显子迁移，剪切形成套索结构，拉近剪切位点，促进序列成环
b. 依赖邻近的反向互补序列配对，拉近剪切位点，使其相互攻击，促进序列成环
c. 单个内含子直接成环
d. RNA结合蛋白、反式作用因子参与成环
研究功能，敲降看看
据文献报道，环状RNA可以被小干扰RNA敲降7。如下图所示，研究者使用了三种siRNA：一种靶向backsplice序列 (si-circHIPK3)，一种靶向线性转录本 (si-HIPK3)，一种靶向线性和环状共有的环状外显子 (si-both)，均由锐博生物提供。接着，研究者通过细胞增殖实验及EdU染色（锐博生物提供）观察敲降后的情况，发现si-circHIPK3能抑制几种不同的细胞生长，而si-HIPK3不能。
通过EdU试验，检测转染3种siRNA 48h后Huh-7细胞的DNA合成情况。
circHIPK3充当miRNA海绵
来自doRiNA的AGO2 CLIP-Seq公开数据显示AGO2位于circHIPK3区域。研究者进行了pull down、荧光素酶报告基因实验，证明了circHIPK3可能是AGO2和miRNA结合的中间媒体。
为了寻找与circHIPK3结合的miRNA，研究者使用荧光素酶筛选miRNA文库。在424个miRNA中，有9条miRNA能够显著减弱荧光素酶报告基因活性。使用TargetScan和PicTarmiRNA预测软件，发现它们含有circHIPK3区结合位点。于是研究者把这些结合位点突变了，转染突变后的miRNA，并不能减少报告基因活性。此项结果表明circHIPK3可能是这些miRNA的海绵 (sponge)。
HEK-293T细胞转染424个miRNA mimic，进行荧光素酶报告基因实验筛选，鉴定它们是否能够与circHIPK3结合。图中标注的9个miRNA对酶活抑制较明显。
值得注意的是，这9种miRNA都能抑制细胞生长，其中miR-124效果最显著，于是研究者使用生物素偶联的miR-124 mimic（锐博生物提供），富集了大量circHIPK3。多个实验的结果综合表明，circHIPK3能够直接结合到miR-124，抑制其活性。
左图：HEK-293T细胞转染3‘偶联链霉亲和素的miR-124后，捕获得的细胞裂解液中circHIPK3水平；右图：转染si-cHIPK3、miR-124或cHIPK3载体到HEK-293T细胞，qRT-PCR检测IL6R和DLX2表达情况。IL6R和DLX2是miR-124的两个已知的增殖促进靶标，会随着circHIPK3的敲降而下调，表明circHIPK3可以挽救miR-124对它们的抑制。
小编说
环状RNA有什么功能和作用？
1. 调控亲本基因表达
仅有内含子的ciRNA与pol II结合促进基因转录
有内含子+外显子的ElciRNA与U1 snRNP形成复合体，再与pol II结合，促进基因转录
2. 充当ceRNA
仅有外显子的circRNA有MRE，吸附miRNA，调控miRNA表达（miRNA海绵）
3. 作为疾病的biomarker
4. 成为新的疾病治疗靶点
