细胞的非玻璃化冻存方法
实验概要
本实验以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍了非玻璃化冻存细胞的详细过程。
主要试剂
冷冻保护液：一般是以 9 份小牛血清或细胞培养液与 1 份 DMSO 混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解。
主要设备
普通冰箱、-30℃低温冰箱和-70℃～-80℃超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；
冻存管：容量为 1ml 或 1.5ml。
实验材料
待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。
实验步骤
1. 待冻存细胞悬液的制备
1) 按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；
2) 将细胞悬液以 800～1000r/min 离心 5min，去上清夜；
3) 向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达 1×106～1×107 个/ml；
4) 按每管 1～1.5ml 的量分装于冻存管内，拧紧管盖；
5) 再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。
2. 分级冷冻
1) 先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～8℃），约 40min；
2) 接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-10℃～-20℃），约 30～60min；
3) 将冻存管转入低温冰箱（-30℃），放置 30min左右；
4) 然后将冻存管转移到超低温冰箱（-70℃～-80℃），过夜；
5) 最后将冻存管投入液氮保存。
3. 记录
做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。
注意事项
1. 在使用 DMSO 前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO 对人体有毒，故在配制时最好带手套。
2. 在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。
3. 应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏 1～2 管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。
4. 冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-196℃的液氮中取出冻存管，立即投入 37～40℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。
