一种高性能时间分辨荧光微球的制备方法和应用与...-1
时间分辨荧光免疫层析分析法(TRFLFI)是一种基于荧光纳米微球标记技术和免疫层析分析技术相结合的快速检测技术，通过荧光纳米微球作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，发生特异性反应后，用时间分辨荧光检测仪测定最后结合物的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，计算出反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。
TRFLFI因其相对较高的灵敏度、准确度、宽线性范围，且操作简便，检测快速等优点，正逐步取代酶联免疫分析技术、胶体金免疫层析技术，广泛应用于食品安全检测、临床医学检测、动物疫病检测、环境检测以及生物学科研检测等领域。尽管TRFLFI相比酶联免疫分析技术、胶体金免疫层析技术已经具有较高的灵敏度，但是因其受到免疫层析反应方式的制约，与化学发光、电化学发光等技术相比，灵敏度方面仍有一定的差距，因此通过提高荧光微球的荧光强度来进一步提升检测的灵敏度迫在眉睫。同时，目前市售的荧光微球的稳定性及抗逆性较差，在不同样本基质中有不同程度的溶胀现象，导至荧光微球中包裹的荧光物质容易发生泄露，因而在不同的样本基质中检测结果差异较大。
另外，用于TRFLFI的荧光微球，其粒径一般在100-400nm之间，具有较大的粒径和表面积，容易对标记的抗体、配体等活性物质产生空间位阻效应，降低抗体、配体等活性物质的亲和力和结合能力，从而降低检测的灵敏度。因此，急需开发一种具有高稳定性、高荧光强度、低空间位阻效应的荧光微球，进一步提升TRFLFI分析方法的性能，使得检测灵敏度更高、线性范围更宽、样本适用范围更广、稳定性更好。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可提高荧光微球稳定性和荧光强度、降低空间位阻效应的高灵敏度时间分辨荧光微球的制备方法，以解决现有技术中的时间分辨荧光微球荧光强度和稳定性不够、空间位阻效应较大等缺陷，进一步提升时间分辨荧光免疫层析技术的检测灵敏度和样本适用范围。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种可提高荧光微球稳定性和荧光强度、降低空间位阻效应的高灵敏度时间分辨荧光微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)高稳定性聚苯乙烯纳米微球的制备：取苯乙烯单体和丙烯酸单体溶解于含十二烷基磺酸钠和葡聚糖的去离子水中，搅拌均匀，然后用高纯氮气将空气除尽，密封加热至75℃，加入过硫酸钾，密封隔氧搅拌反应12h后，降至室温，然后将反应液用whatman2v滤纸过滤，过SephadexG-200分子筛柱，收集最先洗脱下来的组分并浓缩，加入0.05％的迭氮钠4℃保存；
(2)不同离子掺杂铕离子螯合物的制备：用甲醇分别配制三氯化铕、三氯化镱、三氯化镥、β-二酮、三辛基氧化膦溶液，混匀密封保存；取一定量的三氯化铕溶液、三氯化镱溶液、三氯化镥溶液混合均匀，再加入β-二酮和三辛基氧化膦溶液，强力混匀并静置过夜；
(3)高荧光强度纳米微球的制备：取步骤(1)中制备的高羧基密度聚苯乙烯纳米微球，加入去离子水和丙酮的混合液中，搅拌均匀，加入步骤(2)制备的不同离子掺杂铕离子螯合物，37℃恒温搅拌反应24h，最后通过减压蒸馏方式将溶液中的有机溶剂去除，过SephadexG-200分子筛柱，收集最先洗脱下来的组分并浓缩，加入0.05％的迭氮钠4℃保存；
(4)荧光微球表面的去空间位阻效应修饰：取步骤(3)中制备的荧光微球，溶于硼酸缓冲液中，超声处理，然后缓慢加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基珀酰亚胺(NHS)，室温匀速搅拌活化后，离心，收集沉淀，用硼酸缓冲液反复洗涤离心2次；将活化的荧光微球复溶于硼酸缓冲液中，加入NH2-PEG(N)-COOH溶液，室温匀速搅拌，离心、清洗，最后用硼酸缓冲液复溶，加入0.05％的迭氮钠4℃避光保存。
本发明所述的高灵敏度时间分辨荧光微球的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述葡聚糖的分子量为5000-50000，优选为25000。本发明所述的高灵敏度时间分辨荧光微球的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述葡聚糖的浓度为1-16mm，优选为8mm。通过调整葡聚糖的分子量和浓度可以获得不同稳定性的聚苯乙烯纳米微球。本发明所述的高灵敏度时间分辨荧光微球的制备方法，其中，所述步骤(1)中，加热温度为75℃，反应时间为12h。本发明所述的高灵敏度时间分辨荧光微球的制备方法，其中，所述步骤(2)中，离子掺杂的比例为铕离子：镱离子：镥离子＝15：0.5～3.0：0.1～1.0，优选为15：1.5：0.5。本发明所述的高灵敏度时间分辨荧光微球的制备方法，其中，所述步骤(2)中，铕离子、β-二酮和三辛基氧化磷的比例为5～20：50：50，优选为15：50：50。本发明所述的高灵敏度时间分辨荧光微球的制备方法，其中，所述步骤(3)中，NH2-PEG(N)-COOH的分子量为400～20000。通过调节NH2-PEG-COOH的分子量，从而制备不同碳链长度的羧基聚苯乙烯纳米微球，从而获得不同空间位阻效应的荧光微球。本发明所述的可提高微球稳定性和荧光强度、降低空间位阻效应的高灵敏度时间分辨荧光微球作为示踪物标记在食品检测、医学临床检测、生物学科研检测以及环境检测方面应用。
