| 实验步骤 |
一、材料
1. 溶液与缓冲液
氯仿：异戊醇（49:1，V/V）
乙醇
异丙醇
液氮
苯酚
磷酸缓冲盐溶液 PBS（仅供悬浮细胞和单层细胞用）
乙酸钠（2 mol/L，pH 4.0）
溶液 D（变性液）
去离子甲酰胺（可选）
细胞和组织
2. 离心与转子
Sorvall SS-34 (或与之相当的转子）；Sorvall H1000 (或与之相当的转子）
3. 专用设备
测 260 nm 吸光率的比色杯
组织匀浆器
用 DEPC 水处理过、预冷的研棒和研钵
聚丙烯管
65℃ 水浴
二、方法
1. 选取从组织或细胞中提取 RNA 的适宜方法
(1) 组织
① 分离组织并立即置于液氮中。
② 将约 100 mg 冰冻组织含液氮的研钵中，用研棒研磨。研磨过程中可加入液氮使组织保持冰冻状态。
③ 将组织碎末移入含 3 ml 溶液 D 的管中。
④ 用搅拌子室温下搅拌组织 15~30 s。
(2) 哺乳动物悬浮细胞
① 室温下 200~1900 g 离心 5~10 min (1000~3000 r/min 用 Sorvall RT600, H1000 转子）收获细胞。
② 吸出培养基将细胞重悬于 1~2 ml 冰预冷的 PBS 中。
③ 离心收获细胞，彻底吸尽 PBS, 每 106 细胞加 2 ml 溶液 D。
④ 用搅拌子室温下搅拌细胞 15~30 s。
(3) 哺乳动物单层培养细胞
① 吸出培养基用 5~10 ml 冰冷的 PBS 洗细胞一次。
② 吸出 PBS 加入溶液 D 覆盖细胞，90 mm 培养皿加 2 ml ( 60 mm 培养皿加 1 ml)。
③ 将细胞溶解物移至管中。
④ 用搅拌子室温下搅拌溶解细胞 15~30 s。
2. 将混合物移至一管中，在每毫升溶液 D 中立即加入 0.1 ml 2 mol/L 的醋酸钠 ( pH 4.0),1 ml 酚，0.2 ml 氯仿-异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。
3. 将匀浆剧烈振荡 10 s。冰浴 15 min 使核蛋白质复合体彻底裂解。
4. 10000 g ( 9000 r/min 用 Sorvall SS-34 转子）4℃ 离心 20 min, 将上层含 RNA 的水相移入一新管中。
5. 加入与提取的 RNA 等量的异丙醇。充分混合液体，并在 -20℃ 沉淀 RNA 1 h 或更长时间。
6. 10000 g ( 9000 r/min 用 Sorvall SS-34 转子）4℃ 离心 30 min, 收集沉淀的 RNA。
7. 轻轻倒出异丙醇加入溶液 D 溶解 RNA 颗粒，每 1 ml 第一步所使用的溶液加 0.3 ml 溶液 D。
8. 将溶液移至一微量离心管，涡旋混匀，并在 -20℃ 用等量异丙醇沉淀 RNA 1 h 或更长时间。
9. 在微量离心机上，于 4℃ 最大速离心 10 min 收集 RNA 沉淀。用 75% 的乙醇洗涤沉淀 2 次，重复离心。用一次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将打开盖的离心管在实验台放置几分钟，以便乙醇蒸发。RNA 不可完全干燥。
10. 加 50~100 μl DEPC 处理过的水。将 RNA 溶液贮存于 -70℃。
11. 估计 RNA 的浓度。
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