去甲变肾上腺素ELISA试剂盒使用说明（二）
7、实验所需器材（但试剂盒不提供）
1) 移液器，体积：10;50;100;1000ul
2) 玻璃试管（12×75mm）
3) 振荡器（200-900rpm）
4) 旋涡混合器
5) 水浴箱，90℃
6) 带试剂储器的8孔移液器
7) 洗涤瓶，自动或半自动包被板洗涤系统。
8) 可在405nm处读数的酶标仪（参考波长：600-650nm）
9) 双蒸水或去离子水
10) 吸水纸，取样吸头和计时器
8、注意事项
1) 样品的不合理处理及实验操作的任何改动都将影响实验结果。取样体积、温育时间、欲处理步骤都必须严格按说明进行。只能使用标准移液器和标准设备。
2) 一旦实验开始，所有的步骤都必须完整的进行下去，切勿中断。确保所有试剂、材料和设备都已准备好。把所有试剂和样品都平衡至18-25℃，在使用前，轻轻摇动液体试剂和样品，试剂混合过程时要避免产生气泡。
3) 请勿接触试剂、移液器、微孔/试管。加试剂和样本时，请使用新的吸头，以避免交叉污染。不用的试剂应用盖子盖好，以免重复使用。
4) 我们建议对样品进行双份检测，以便能纠正潜在的滴定错误
5) 用定标仪对反应板进行校准。
6) 温育时间会影响实验结果。微孔加样的顺序和时间都必须一致。建议使用8孔移液器加样。
7) 包被板的清洗很重要，清洗不合理将会导致错误的实验结果。建议使用多孔移液器或自动包被板清洗系统进行清洗。温育期间避免微孔干燥，清洗和吸液时不要碰到包被板微孔。清洗时，确保所有的微孔都充满蒸馏水，并且无残留物。
8) 湿度会对包被孔产生影响，所以包被板未平衡到室温时不要打开包装。不使用的微孔应立即装入含干燥剂的包装袋中。
9、实验前的准备说明
手动或自动操作参考说明
注意 | 这种96人份的试剂盒可分成3份独立进行，以下体积为4条（32人份）一次检测所需体积。如果想把标准品从7份减到6份，可以把标准品G弃取。而允许范围相应的减少到3000μg/l。 |
如果检测是用了很多板条，则体积应相应改变。
9.1冻干成分或浓缩成分的准备
特别注意 | 如果你使用甲状腺ELISA试剂盒来同时检测间甲肾上腺素和去甲变肾上腺素，请勿混合间甲肾上腺素和去甲变肾上腺素酶联物。 | ||||||
稀释/溶解 | 成分 | 稀释 | 比例 | 备注 | 贮存 | 稳定性 | |
15mL | 检测用缓冲液 | 150mL | 双蒸水 | 1:10 | 2-8°C | 2周 | |
15mL | 洗涤液 | 150mL | 双蒸水 | 1:10 | 2-8°C | 4周 | |
1瓶 | 去甲变肾上腺素生物素 | 2mL | 稀释的检测缓冲液 | 临时配制,仅使用一次,静置5min,混合时避免气泡. | ≤-20°C | 2个月 | |
60μl | 酶联物 | 6mL | 稀释的检测缓冲液 | 1:101 | 临时配制,仅使用一次 | 18-25°C | 5小时 |
3 | PNPP底物片 | 8mL | PNPP底物缓冲液 | 临时配制,仅使用一次 | 18-25°C | 5小时 |
9.2总去甲变肾上腺素检测用的尿液样品、标准品和质控品的水解（在水解试管中）
注意 | 水解这一步骤在总去甲变肾上腺素和总间甲肾上腺素的检测中是必备的。而在游离去甲变肾上腺素和变肾上腺素的检测中则无须水解。样品被怀疑高于最高标准的样品必须在水解步骤前用0.1M HCL进行稀释。 |
9.2.1水解试管中样品的准备
1) 将标准品、质控品和尿液样品各10μL加入到相应的水解试管中
2) 在每一试管中加入40μL0.1M的HCl。
3) 盖好试管，90°C下水解1h（用温度计测温度）。之后平衡至室温，旋涡混合。
4) 在每一试管中加入100μL指示剂缓冲液，旋涡混合。
5) 在每一试管中加入20μL的酰化作用试剂，加入指示剂后立即震荡，确保加入的酰化试剂和试管内物质完全混合。
6) 盖好试管，室温下温育15min。
7) 在每一试管中加入1mL稀释的检测缓冲液。
10、实验步骤
手动和自动操作
1) 将酰化标准品、酰化质控品和酰化病人样品分别50μL加入到相应的微孔中。
2) 在每一微孔中加入50μL去甲变肾上腺素生物素。
3) 在每一微孔中加入50μL去甲变肾上腺素抗血清。
4) 盖板，小心振荡包被板。振荡器（500rpm）上室温温育1h（500rpm）
5) 移去粘性金属板。弃取孔内反应液，每孔用250μL洗涤液洗板6次（洗板机洗）,(人工清洗则洗3次即可)，吸水纸上拍干。
6) 在每一微孔中加入150μL临时配制的酶联物。
7) 盖上一新的粘性金属板。振荡器（500rpm）上室温（18-25℃）温育30min。
8) 移去粘性金属板。弃取孔内反应液，每孔用250μL洗涤液洗板6次（洗板机洗）,(人工清洗则洗3次即可)，吸水纸上拍干。
9) 如果有条件的话，使用8孔微量移液器加底物液和终止液时。确保底物液和终止液都是相同的时间间隔加入。使用自动置换型移液器并避免气泡产生。
10) 在每一微孔中加入100μL临时配制的PNPP底物液。
11) 振荡器（500rpm）上室温（18-25℃）温育20min。
12) 在每一微孔中加入100μL PNPP终止液以终止底物反应，轻轻振板以混合溶液。
13) 加入终止液后60min之内在405nm处测OD值（参考波长：60 0-650nm）
11、结果计算
在半对数坐标纸上或用自动的方法，以标准品的OD值为Y轴，浓度为X轴，绘制一条标准曲线。用立体图、4参数对数图或对数-对数图都可获得良好的实验结果。对于标准曲线图，用标准品的每一单值进行计算（样品结果明显异常的值必须删除掉，应使用更加合理的单值）。样品的浓度可直接从标准曲线上获得。一旦样品稀释了，就应当乘以相应的稀释因子。如果样品所测得的浓度高于最高标准，则应根据实验前准备说明所述对样品进行稀释，并重新检测。
计算每一尿液样品的24小时的排泄量：μg/24h=μg/L×L/24h
转换：1ng/mL=1μmol/L
去甲变肾上腺素(μg/L)×5.46×10-3=μmol/L
12、期望值
实验结果不能当作判断任何治疗结果的唯一因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（5%-95%）：
平均值：230ug/d 范围：35-445ug/d（95%）
建议每个实验室都确定自己实验室的正常值范围。
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
