高内涵细胞分析仪的细胞生物学应用——癌症相关研究 二
2. 克隆形成实验
细胞的克隆形成实验被广泛应用于癌症的临床和机理研究中，人们以此来评价细胞群体在体外的功能状况。其中一些重要的研究领域就包括了细胞毒性评估、细胞转化研究以及预测肿瘤细胞对各种化学治疗试剂的反应。过去，克隆计数实验是在半固体的琼脂糖双层系统上进行的，需要在显微镜下一个一个地数，非常费时费力，并且无可避免的引入了人为的主观因素的影响。一般的高内涵图像分析系统，由于景深有限，不能准确分辨大体积的克隆；而且它的成像面积较小，又不能对全孔进行克隆计数。
Acumen eX3 能够自动地对24 或96 孔板进行高内涵的全孔扫描，软件独有的体积算法能精确测量克隆大小。细胞经过calcein-AM 染色后，可在选定的时间点来监测克隆的生长，精确区分孔内含有指定细胞数量的克隆，这能帮助用户区分细胞簇和克隆，从而精确计数。一般来说，细胞克隆被认为含有20 个以上的细胞（图2，红色），而细胞簇不足20 个细胞（图2，绿色）。传统的格子计数法对于某些克隆来说就会显得无计可施（如图2中的克隆2）。而Acumen eX3 鉴定了孔中的所有荧光目标，这也意味着所有克隆都能被准确地鉴定和分类。在表1中显示了图2中标记的3 个克隆的面积和体积测量结果（表1）。通过比较可以发现，使用面积作为测量参数相对于使用体积作为测量参数，低估了克隆的尺寸。例如，克隆2 由于其形状和在孔中的分布方向所致，使得它的体积/面积比要远远大于克隆1 和克隆3。
图2Acumen eX3 软件对细胞克隆的鉴定及分类
表1 Acumen eX3 计算的3个克隆的相关参数
显然Acumen eX3这种利用体积读数来对细胞克隆形成进行评估的方法，避免了由于细胞毒性等引起细胞在数目和外形上的不同而造成的误差，无疑提供了一种优异的检测克隆形成的实验方法6。
3. 血管生成实验
血管生成（angiogenesis）是癌症转移所必需的条件，肿瘤的血管生成是指血管网络的增殖，这些血管渗透到癌细胞周围，为之提供营养和氧气，并带走废物。肿瘤的血管生成实际受所释放的生长因子的调控。这些信号激活了宿主组织中的某些基因，翻译生成的蛋白会促进新血管的生长。因而科学家一直寄希望于能够通过干扰肿瘤的血管生成来治疗癌症。
Acumen eX3的大视野能力支持24或96多种规格的微孔板。在生长因子刺激后，细胞用calcein-AM 染色，通过Acumen eX3扫描后，血管生成的数量就可轻松确定8。软件会得到总的血管面积；也可以将图像输出，由Image Pro Plus进行血管长度以及分支数量的测定。
4. 细胞迁移实验
细胞迁移是高度整合、复杂调控的过程，细胞迁移的调控异常涉及到癌症、黄斑退化和糖尿病、伤口愈合等多种疾病。肿瘤细胞的侵袭和转移能力是恶性肿瘤的基本生物学特征，因此肿瘤细胞迁移的研究对癌症的防止有着重要的意义。近年来，关于评估细胞迁移的实验方法越来越精细，取代了之前Boyden 小室方法。
Acumen eX3结合Oris™细胞迁移分析（http://www.platypustech.com）的ZL技术实现了在在微孔板上进行细胞迁移实验，利用独特的细胞接种塞来产生一个能观察细胞迁移和侵袭的检测区域。硅胶塞插入96 孔板的每个孔中，接种后4-18 个小时，贴壁细胞附着在硅胶塞以外的区域，形成一个环。去除硅胶塞后，孔中心形成直径2 mm的圆形区域没有附着任何细胞，区域外的细胞会向内迁移，此区域即可用于检测细胞迁移的速率。
图5 Oris™细胞迁移板在Acumen eX3 上进行的分析，并支持多种荧光标记。
由于Acumen eX3在成像面积和计数效率方面的优势，大大提高了整个实验的效率，96孔板扫描分析不超过10分钟。更重要的是避免了传统的划痕法引入的人为操作误差9-10。
参考文献
1. Kittler, R. et al. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat. Cell Biol. 9, 1401-12 (2007).
2. Kittler, R. et al. An endoribonuclease-prepared siRNA screen in human cells identifies genes essential for cell division.Nature 432, 1036–1040 (2004).
3.Cheng et al. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement for miRNA in cell growth and apoptosis. Nucleic Acids Res. 33(4):1290-7 (2005)
4. Chresta et al., AZD8055 is a potent, selective, and orally bioavailable ATP-competitive mammalian target of rapamycin kinase inhibitor with in vitro and in vivo antitumor activity.., Cancer Res. Jan 1;70(1):288-98 (2010)
5.Phong et al., The p38 MAPK promotes cell survival in response to DNA damage butis not required for G2 DNA damage checkpoint in human cancer cells Mol Cell Biol.Jun 1 (2010)
6.Wylie & Bowen Determination of cell colony formation in a high-content screening assay Clin Lab Med 27(1):193-9(2007)
7.Wedge et al. AZD2171: A highly potent, orally bioavailable, vascular endothelial growth factor receptor-2 tyrosine kinase inhibitor for the treatment of cancer. Cancer Res 65(10):4389-400 (2005)
8.Kunz-Schughart, L. A. et al., Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensionalvessel-like structures from endothelial cells in vitro Am J Physiol Cell Physiol 290 (5), C1385 (2006)
9.Hulkower K, Perr M, Quantifying Cell Migration and Invasion. GEN, 2008;
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10.Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR, "A Simple Statistical Parameter for Use in
Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays."J Biomol Screen.
1999; 4(2):67-73.
